Summary

用いて、化合物の生理活性をスクリーニングするためのペアNanoinjectionと電気生理学的アッセイキイロショウジョウバエジャイアントファイバシステム

Published: April 15, 2012
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Summary

急速な<emin vivoでの></em>検定の巨大ファイバシステム(GFS)を使用して、神経調節化合物をテストするための<em>キイロショウジョウバエ</em>記載されています。 GFSの電気生理学的記録と一緒に動物の頭の中でNanoinjectionsは、ニューロンや筋肉に対する化合物の生物活性を明らかにすることができます。

Abstract

in vivo活性のスクリーニング化合物は薬理学的作用物質1,2に開発することができる候補者を識別するための最初のステップとして使用することができます。我々は、仲介キイロショウジョウバエ 3,4のエスケープ応答を神経回路の機能に対する化合物の生理活性調節作用の検出を可能にする新たなnanoinjection /電気アッセイを開発しました。私たちの(GFS、 図1)ショウジョウバエの巨大な光ファイバシステムを使用してin vivoでのアッセイでは、このような小分子またはペプチドなどの化合物、さまざまな種類のスクリーニングを可能にし、最小限の量が効果を引き出すために必要になります。さらに、ショウジョウバエGFSは、ニューロンや筋肉の潜在的な標的分子の多種多様を提供しています。ジャイアント繊維(GFS)周辺Synapsing介在ニューロン(PSI)とTergo Trochanteral筋ニューロン(TTMn 5)上に化学的に電気シナプス(ギャップジャンクション)と同様に(コリン) </> supの。 DLMn(背縦走筋ニューロン)接続へPSIはDα7ニコチン性アセチルコリン受容体(nAChRs)6に依存しています。最後に、ジャンプ(TTM)と飛翔筋(DLM)のTTMnとDLMnの神経筋接合部(NMJ)は7月12日グルタミン酸作動性である。ここでは、巨大な光ファイバシステム13とどのようにこの回路の機能に対する化合物の影響を監視するための電気生理学的な細胞内記録を得ながら、化合物のナノリットル量を注入する方法を示しています。我々は、接続をDLMnするPSIはなく、接続やジャンプや飛翔筋におけるNMJの機能をTTMnするGFを乱すmethyllycaconitineクエン酸(MLA)、のnAChR拮抗薬とのアッセイの特異性を示しています。

このビデオを開始する前に、それはあなたが注意深く見るとD.メランの巨大ファイバ経路からの"電気生理学的記録と題しJoveの映像に慣れていることが重要ですオーギュ 7からogaster "、ビデオはここで提示されるように、この既存の技術の拡張として意図されています。ここでは、唯一のペアnanoinjectionsとモニタリング技術のほかに詳細に電気生理学的記録法とフォーカスを使用しています。

Protocol

1。電気生理学リグのセットアップ電気生理学リグセットアップに必要な機器は、オーギュらによって詳細に記載されている。このジャーナル14インチ必要に応じて電気機器の詳細な説明については、この資料を参照してください。 ナノインジェクタを保持する第六マイクロマニピュレータを追加することによって、前述した電気生理学リグのセット、最大14?…

Discussion

ここに提示nanoinjection /電気生理学的アッセイは、ショウジョウバエの神経系の化合物の迅速なスクリーニングが可能になります。これは、よく特徴付けられた神経回路内での分子標的のさまざまな効果を引き出すために化合物の少量を必要とするin vivoでの技術小説です。このメソッドは、未知の毒素から市販されている薬剤に応じて、異なる化合物の生物活性をテストするた…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

我々はコメントを、特定のアリーン米沢では、マリラボとGodenschwegeラボのメンバーを認識し、このプロトコルを支援したいと思います。この作品は、神経疾患のための国立研究所とFMとTAGのストローク助成R21NS06637によって賄われていた。ABは、国立科学財団賞を受賞番号082925、URMによって資金を供給された:将来の研究者のための統合生物学。

Materials

Name of the reagent Company Catalogue number Comments
Recording glass electrodes: borosilicate glass capillaries World Precision Instruments 1B100F-4 1.0mm OD, 0.58mm ID
Stimulator Grass Instruments Model S48  
Amplifier Getting Instruments Inc. Model 5A  
Data acquisition Software: Digidata Molecular Devices Model 1440A  
Data collection software: pCLAMP Molecular Devices Version 10  
Stereomicroscope with fiber optic microscope ring illuminator AmScope SM-4T
Model HL250-AR
 
Dissecting scope for mounting AmScope SM-2TZ  
Kite Manual Micromanipulator & Tilting Base World Precision Instruments Model # M3301
Kite: Model # KITE-M3-L
 
Drosophila melanogaster Wild 10E genotype (wild type strain) Bloomington Stock center Stock # 3892  
Vertical pipette puller David Kopf Instruments Model 700c  
Injection glass micropipettes: Borosilicate glass capillaries World Precision Instruments Catalogue # 4878 1.14mm OD, 0.5mm ID
Silicon oil Fisher Catalogue # S159-500  
Beveler Sutter Instrument Co. K.T. Brown Type
Model # BV-10
 
Nanoliter2000 World Precision Instruments Catalogue # B203XVY  
Blue food coloring McCormick N/A Ingredients: Water, Propylene Glycol, FD&C Blue 1, and 0.1% Propylparaben (preservative).
Methyllycaconitine citrate (MLA) Tocris Bioscience Catalogue # 1029  
Plastic wax sticks Hygenic Corporation (Akron Ohio USA)    

References

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Mejia, M., Heghinian, M. D., Busch, A., Marí, F., Godenschwege, T. A. Paired Nanoinjection and Electrophysiology Assay to Screen for Bioactivity of Compounds using the Drosophila melanogaster Giant Fiber System. J. Vis. Exp. (62), e3597, doi:10.3791/3597 (2012).

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