Parret Nanoinjection og Elektrofysiologi Assay til screening for bioaktivitet af forbindelser ved hjælp af Drosophila melanogaster Giant fibersystem
Summary
En hurtig<em> In vivo</em> Assay til at teste for neuromodulatory forbindelser under anvendelse af Giant Fiber System (GFS) af<em> Drosophila melanogaster</em> Er beskrevet. Nanoinjections i hovedet af dyret sammen med elektrofysiologiske optagelser af GFS kan afsløre bioaktivitet af forbindelser på neuroner eller muskler.
Abstract
Screening af forbindelser for aktivitet in vivo, kan anvendes som et første trin til at identificere kandidater, der kan udvikles til farmakologiske midler 1,2. Vi udviklet et hidtil ukendt nanoinjection / elektrofysiologi assay, som tillader påvisning af bioaktive modulatoriske virkninger af forbindelser på funktionen af en neuronal kredsløb, der medierer flugtrespons i Drosophila melanogaster 3,4. Vores in vivo assay, der anvender Drosophila Giant Fiber System (GFS, figur 1) tillader screening af forskellige typer af forbindelser, såsom små molekyler eller peptider, og kræver kun minimale mængder til at fremkalde en virkning. Desuden tilbyder Drosophila GFS en lang række potentielle molekylære mål på neuroner eller muskler. De Giant Fibers (GFS) synapse elektrisk (gap junctions) samt kemisk (kolinerge) på en ekstern Synapsing Interneuron (PSI) og Tergo trochanterale Muscle neuron (TTMn) 5 </sup>. PSI til DLMn (Dorsal Longitudinal Muscle neuron) tilslutning er afhængig Dα7 nikotinacetylcholinreceptorer (nAChRs) 6. Endelig neuromuskulære junctions (NMJ) af TTMn og DLMn med spring (TTM) og fly muskler (DLM) er glutamaterge 7-12. Her vil vi vise, hvordan man kan injicere nanoliter mængder af et stof, mens få elektrofysiologiske intracellulære optagelser fra Giant Fiber System 13 og hvordan man kan overvåge virkningerne af forbindelsen på funktionen af dette kredsløb. Vi viser specificiteten af assayet med methyllycaconitine citrat (MLA), en nAChR-antagonist, som forstyrrer PSI DLMn forbindelse, men ikke GF til TTMn forbindelse eller funktionen af NMJ ved hop eller flugt muskler.
Inden du begynder denne video er det vigtigt, at du nøje se og blive fortrolig med JOVE video med titlen "Elektrofysiologiske Optagelser fra Giant Fiber Pathway af D. melanogaster "fra Augustin et al 7, som videoen præsenteres her er tænkt som en udvidelse til den eksisterende teknik. Her bruger vi elektrofysiologiske optagelser metode og fokuserer i detaljer kun på tilsætning af de parrede nanoinjections og overvågning af teknik.
Protocol
Discussion
Den nanoinjection / elektrofysiologi bioassay præsenteret her tillader en hurtig screening af forbindelser i nervesystem frugtflue. Dette er en hidtil ukendt in vivo teknik, der kræver små mængder af en forbindelse til at fremkalde en effekt på en række forskellige molekylære mål i en velkarakteriseret neuronal kredsløb. Denne fremgangsmåde kan anvendes til at teste den biologiske aktivitet af forskellige forbindelser, fra ukendte toksiner til kommercielt tilgængelige farmakologiske midler.
<p cl…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vil gerne takke medlemmerne af Mari laboratoriet og Godenschwege laboratoriet, især Aline Yonezawa, for kommentarer og hjælpe med denne protokol. Dette arbejde blev finansieret af det nationale institut for neurologiske sygdomme og slagtilfælde tilskud R21NS06637 til FM og TAG, AB blev finansieret af National Science Foundation prisen nummer 082925, URM: Integrative Biology for fremtidens forskere.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Recording glass electrodes: borosilicate glass capillaries | World Precision Instruments | 1B100F-4 | 1.0mm OD, 0.58mm ID |
| Stimulator | Grass Instruments | Model S48 | |
| Amplifier | Getting Instruments Inc. | Model 5A | |
| Data acquisition Software: Digidata | Molecular Devices | Model 1440A | |
| Data collection software: pCLAMP | Molecular Devices | Version 10 | |
| Stereomicroscope with fiber optic microscope ring illuminator | AmScope | SM-4T Model HL250-AR |
|
| Dissecting scope for mounting | AmScope | SM-2TZ | |
| Kite Manual Micromanipulator & Tilting Base | World Precision Instruments | Model # M3301 Kite: Model # KITE-M3-L |
|
| Drosophila melanogaster Wild 10E genotype (wild type strain) | Bloomington Stock center | Stock # 3892 | |
| Vertical pipette puller | David Kopf Instruments | Model 700c | |
| Injection glass micropipettes: Borosilicate glass capillaries | World Precision Instruments | Catalogue # 4878 | 1.14mm OD, 0.5mm ID |
| Silicon oil | Fisher | Catalogue # S159-500 | |
| Beveler | Sutter Instrument Co. | K.T. Brown Type Model # BV-10 |
|
| Nanoliter2000 | World Precision Instruments | Catalogue # B203XVY | |
| Blue food coloring | McCormick | N/A | Ingredients: Water, Propylene Glycol, FD&C Blue 1, and 0.1% Propylparaben (preservative). |
| Methyllycaconitine citrate (MLA) | Tocris Bioscience | Catalogue # 1029 | |
| Plastic wax sticks | Hygenic Corporation (Akron Ohio USA) |
References
- Koehn, F. E., Carter, G. T. The evolving role of natural products in drug discovery. Nat. Rev. Drug Discov. 4, 206-220 (2005).
- Miljanich, G. P. Ziconotide: neuronal calcium channel blocker for treating severe chronic pain. Curr. Med. Chem. 11, 3029-3040 (2004).
- Layer, R. T., Wagstaff, J. D., White, H. S. Conantokins: peptide antagonists of NMDA receptors. Curr. Med. Chem. 11, 3073-3084 (2004).
- Lewis, R. J. Conotoxins as selective inhibitors of neuronal ion channels, receptors and transporters. IUBMB Life. 56, 89-93 (2004).
- Allen, M. J., Godenschwege, T. A., Tanouye, M. A., Phelan, P. Making an escape: development and function of the Drosophila giant fibre system. Semin. Cell Dev. Biol. 17, 31-41 (2006).
- Fayyazuddin, A., Zaheer, M. A., Hiesinger, P. R., Bellen, H. J. The nicotinic acetylcholine receptor Dalpha7 is required for an escape behavior in Drosophila. PLoS biology. 4, e63 (2006).
- Jan, L. Y., Jan, Y. N. L-glutamate as an excitatory transmitter at the Drosophila larval neuromuscular junction. The Journal of physiology. 262, 215-236 (1976).
- Usherwood, P. N., Machili, P., Leaf, G. L-Glutamate at insect excitatory nerve-muscle synapses. Nature. 219, 1169-1172 (1968).
- Marrus, S. B., Portman, S. L., Allen, M. J., Moffat, K. G., DiAntonio, A. Differential localization of glutamate receptor subunits at the Drosophila neuromuscular junction. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 24, 1406-1415 (2004).
- Petersen, S. A., Fetter, R. D., Noordermeer, J. N., Goodman, C. S., DiAntonio, A. Genetic analysis of glutamate receptors in Drosophila reveals a retrograde signal regulating presynaptic transmitter release. Neuron. 19, 1237-1248 (1997).
- Qin, G. Four different subunits are essential for expressing the synaptic glutamate receptor at neuromuscular junctions of Drosophila. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 25, 3209-3218 (2005).
- Schuster, C. M. Molecular cloning of an invertebrate glutamate receptor subunit expressed in Drosophila muscle. Science. 254, 112-114 (1991).
- Tanouye, M. A., Wyman, R. J. Motor outputs of giant nerve fiber in Drosophila. Journal of. 44, 405-421 (1980).
- Augustin, H., Allen, M. J., Partridge, L. Electrophysiological Recordings from the Giant Fiber Pathway of D. melanogaster. J. Vis. Exp. (47), e2412 (2011).
- Allen, M. J., Godenschwege, T., Zhang, B., Freeman, M. R., Waddell, S. . Drosophila Neurobiology. , 215-224 (2010).
- Blagburn, J. M., Alexopoulos, H., Davies, J. A., Bacon, J. P. Null mutation in shaking-B eliminates electrical, but not chemical, synapses in the Drosophila giant fiber system: a structural study. J. Comp. Neurol. 404, 449-458 (1999).
- Thomas, J. B., Wyman, R. J. Mutations altering synaptic connectivity between identified neurons in Drosophila. J. Neurosci. 4, 530-538 (1984).
- Baird, D. H., Schalet, A. P., Wyman, R. J. The Passover locus in Drosophila melanogaster: complex complementation and different effects on the giant fiber neural pathway. Genetics. 126, 1045-1059 (1990).
- Gorczyca, M., Hall, J. C. Identification of a cholinergic synapse in the giant fiber pathway of Drosophila using conditional mutations of acetylcholine synthesis. J. Neurogenet. 1, 289-313 (1984).
- Allen, M. J., Murphey, R. K. The chemical component of the mixed GF-TTMn synapse in Drosophila melanogaster uses acetylcholine as its neurotransmitter. The European journal of neuroscience. 26, 439-445 (2007).
- Mejia, M. A novel approach for in vivo screening of toxins using the Drosophila Giant Fiber circuit. Toxicon. 56, 1398-1407 (2010).
- Stork, T. Organization and function of the blood-brain barrier in Drosophila. J. Neurosci. 28, 587-597 (2008).
