1. Het maken van horizontale entorhinale-hippocampus hersencoupes Entorhinale-hippocampale hersenen plakken worden gemaakt met behulp van anatomische gidsen, uitgewerkt in een 3D-overzicht van de regio volgens de Canto, Wouterlood & Witter (2008) neurale plasticiteit ID 381243 9. Maak 500ml van slice-oplossing, zuurstof met carbogen gas (95% zuurstof, 5% kooldioxide) gedurende ten minste 20 minuten en dan bevriezen 250ml tot ijs. Minuten voor het snijden, pletten en mengen het plakje ijs met de resterende 250 ml borrelen slice-oplossing te worden gebruikt voor dissectie en voor het snijden in het snijden kamer. Maak 200ml van r-ACSF (herstel ACSF) en ten minste 500 ml van e-ACSF (experimentele ACSF) oplossing. Continu zuurstof beide oplossingen met carbogen gas (95% zuurstof, 5% kooldioxide) gedurende ten minste 20 minuten voor het prepareren van weefsels. Dit protocol geldt voor muizen van postnatale dag 0 tot een maximum van 3 weken oud. Onthoofden de animal, volgens de lokale ethische commissie procedures, en ontleden van de hersenen al snel in een petrischaal met ijskoude slice bereide oplossing in stap 1, boven (zie tabel 1 voor oplossingen en reagentia). Overdracht van de hersenen op een filterpapier doordrenkt met slice-oplossing en scheid de twee hemisferen met een scherp scheermesje. Terug te zetten een halfrond in ijskoude slice oplossing. Verwijder de kleine hersenen van het andere halfrond. Flip de hersenen op zijn middellijn en sneed de bovenkant van de hersenen met een lichte hoek naar de rostrale einde. Flip de hersenen op de cut (dorsale) oppervlak en lijm deze op het weefsel houder van de snijmachine op z'n kop door zachtjes duwen met een wattenstaafje. Snijd 300 micrometer dikke hersenen plakken met behulp van een lage frequentie en snelheid in de overige ijskoude slice oplossing gemaakt in stap 1. Onder onze voorwaarden, gebruiken we een Thermo Fisher Scientific vibratome (Microm, HM 650V) op de instellingen 0,05 mm / s en 36Hz. AlsZodra een slice wordt gesneden, breng deze over in een slice houder (onder water) met zuurstofrijk Kunstmatige Cerebro Spinal Fluid (ACSF) (2,5 Mg 2 +, 1,6 mm Ca 2 +, zie tabel 2) bij kamertemperatuur. Een hogere magnesium concentratie in r-ACSF vermindert de instroom van calcium in neuronen via NMDA-receptoren na het snijden en in onze ervaring, leidt tot een betere kwaliteit van de schijfjes voor experimenten. Indien nodig, daarna snijden de tweede hersenhelft. Laat de plakjes een uur om te herstellen. Snijd oplossing (in mm) – 10 110 choline chloride 25 NaHCO 3 11,6 11,6 10 D-glucose 7 MgCl 2 3.1 sodiumpyruvate 2.5 KCl 1,25 NaH 2 PO 4 0.5 CaCl 2 Tabel 1. Recept voor slice oplossing. ACSF (in mm) 125 NaCl 26 NaHCO 3 10 D-glucose 3 KCl 2.5/1.5 MgCl 2 (herstel / experiment) 1.6 CaCl 2 1,25 NaH 2 PO 4 Tabel 2. Recept voor zowel nuttige toepassing (r-ACSF) en experimentele (e-ACSF) oplossing. 2. Voorbereiding van de kleuring lamber Voor het laden van de cellen met de calcium-afhankelijke indicator of cel-specifieke marker, plakjes moeten worden overgedragen aan een kamer voor de kleuring procedure. Hoewel commerciële kamers beschikbaar zijn, kan men gemakkelijk worden samengesteld uit standaard lab-apparatuur voor zeer weinig kosten. De belangrijkste kenmerken van een dergelijke kamer zijn dat de schijfjes worden opgewarmd tot tussen de 30 en 35 ° C, geïncubeerd in een continu zuurstof medium is en dat de kamer is afgeschermd van licht. Met behulp van een verwarmde staaf, maak een klein gat in de zijwand van de twee wegwerp polystyreen petrischalen (35 en 100mm diameter), dat is net groot genoeg om een deel van silicium buis (diameter ca. 1,5 mm) te laten passeren. Rijg de siliconen slang door het gat in de kleine petrischaal en vormen een lus in de binnenwand van de kleine schotel. Gebruik secondelijm aan het open uiteinde van de slang afdichting en de rest van de slang vast aan de binnenwand van de petrischaal. </li> Met behulp van een naald, maken fijne gaten gelijkmatig verdeelde intervallen in de slang binnen de binnenste petrischaal. Lijm de kleinere petrischaal in de grotere, met een lijn beide gaten. Rijg het andere uiteinde van de siliconen slang door het gat in de wand van de grote petrischaal. Voor de interface schotel, neem een celkweek goed invoegen met semi-permeabel membraan en het gebruik van een verwarmde scalpel, snij de bovenkant 1 cm afstand tot een ondiepe schaal te laten aan de schijfjes te houden tijdens de incubatie. Op het deksel van de grotere petrischaal, maak een gat ca. 0,5-1cm diameter te zorgen voor carbogen (95% O 2, 5% CO 2) te stromen in de kamer. Neem een 5 of 10 ml plastic spuit. Met behulp van een verhitte scalpel, maak een hoek afgesneden aan het eind van de spuit te verwijderen en een paar cm lengte van de spuit buis te houden met de punt. Met behulp van superlijm, bevestig het snijvlak van de spuit buis om de petrischaal deksel, over de 0,5-1cm diameter gat. Bevestig silicium buizen en opubing connector aan op de spuit. Bevestig een slang aan op de silicium buizen het invoeren van de basis van de petrischalen. Sluit beide buizen tot een regulator voor de carbogen (95% O 2, 5% CO 2) te leveren. Plaats de kleuring kamer op een hete plaat voor incubatie tussen de 30-35 ° C. Zorg ervoor dat de kamer kan worden afgeschermd van het licht tijdens het gehele proces van incubatie. De kleuring kamer is nu klaar in elkaar te zetten en voor slice incubatie gebruik. Methodologie Figuur 1. Dwarsdoorsnede van de kleuring kamer met slice incubatie (boven) en de toepassing van calcium-gevoelige indicator (gepipetteerd groene kleurstof, hieronder). 3. Kleuring van plakjes Gedurende een behandeling waarbij fluorescerende kleurstoffen, vermijd fotobleken door te werken met weinig licht en houden de kleurstof en thij gekleurd weefsel in het donker tussen de handling. Zet de kleuring kamer op een warmte plaat (35 ° C), sluit hem aan een carbogen levering van gas en vul deze met ongeveer 1,5 ml r-ACSF van de slice houder. Plaats de interface gerecht in de kleuring kamer en vul het met 1 ml ACSF. Zorg voor een goede carbogen aanbod in de kleuren van kamer naar de ACSF borrelen te houden op een zachte, gelijkmatige snelheid. Voeg 9 ul DMSO en 1 pi Pluronic zuur (20% in DMSO voorraad oplossing, Invitrogen) in een flacon van 50 ug Fura 2-AM. Vortex de kleurstof mix gedurende 15 minuten. Breng de plakjes in de interface schotel en pipet de kleurstof in de r-ACSF direct over de hippocampus en de cortex entorhinale regio van belang, zoals aangegeven in figuur 1 Methodologie (boven), het bereiken van een uiteindelijke concentratie kleurstof van 50 mm. Sluit het deksel van de kleuring kamer en incubeer de kleurstof voor 20 – 40 minuten, afhankelijk van de leeftijd van het dier (zie tabel 3). Transfer de plakjes terug in de slice houder. Leeftijd (postnatale dag) Incubatie tijd (min) <P8 20 p8-P9 25 p10-p11 30 p12-13 35 > P13 40 Tabel 3. Incubatie tijden voor verschillende leeftijden, empirisch bepaald in het lab. 4. Andere kleurstoffen en ouder weefsel Misschien door de toegenomen myelinisatie in het hersenweefsel, plakjes van oudere knaagdieren niet nemen Fura 2-AM ester die gemakkelijk. Om de opname van deze kleurstof een pre-incubatie stap met behulp van Cremophor EL (Sigma) is voor de hersenen van muizen gebruikt op P13 en ouder 11 te vergemakkelijken. Cremophor is een niet-ionische oppervlakteactieve stof die als hulpstof in vele farmacieal toepassingen. Zonder deze stap, vinden we dat de cel-specifieke etikettering is zeer slecht en niet overal in de corticale slice. Overdracht oude plakken in een ondiepe schaal gevuld met pre-incubatie 3 ml r-ACSF en 8 pi 0,5% Cremophor (Sigma), verwarmd tot 35 ° C gedurende 3 minuten. Breng de plakjes in de interface schotel en volg de normale vlekken procedure (stappen 4-7, zie boven). Calcium kleurstoffen load zowel neuronen als niet-neuronen in de slice voorbereiding. Te identificeren en te onderscheiden van deze celtypen binnen het netwerk, kan sulforhodamine 101 (SR101) worden gebruikt om het etiket astrocytes binnen de slice. Kleuring van plakjes voor sulforhodamine 101 Volg de stappen 1-3 als voorheen (deel 3). Neem een ui van 10 mM stockoplossing van sulforhodamine (Sigma) uit de opslag bij -20 ° C en los op in 999 ul r-ACSF om een 10 pM oplossing te geven. Pipetteer de paarse kleurstof ovER de plakjes als voorheen (stappen 5-7), waardoor de schijfjes incuberen gedurende een periode van 15 minuten. Microglia en endotheelcellen worden geëtiketteerd met FITC tomaat lectine kleurstof Volg de stappen 1-3 als voorheen. Neem 25 ul van 2mg/ml Lycopersicon esculentum (tomaat) lectine FITC-conjugaat (L0401, Sigma) voorraad-oplossing in 2,5 ml r-ACSF tot 20 pg / ml concentratie te geven. Pipetteer de kleurstof over de plakjes als voorheen (stappen 5-7), waardoor de schijfjes incuberen gedurende een periode van 45 minuten. Let op, het is niet mogelijk om deze kleurstof te combineren met een calcium-gevoelige indicator, zoals Fura 2-AM of Oregon Green BAPTA-1 (OGB-1) die fluoresceren in het groene gebied van het spectrum, omdat de fotonen uit beide kleurstoffen zal worden uitgezonden bij overlappende golflengten. Echter, er zijn andere calcium-indicator kleurstoffen zoals calcium oranje, rood Fura die kunnen worden gebruikt in combinatie met passende filters of Texas-Rood lectine conjugaten te weten te combinerenh calcium-indicator kleurstoffen in het groene spectrum. 5. Bevestigen plakken om de opname kamer Tijdens de beeldvorming plakjes moeten stabiel zijn onder de microscoop. Meestal wordt er een metalen harp wordt geplaatst ingedrukt houden het weefsel, maar het kan ongelijkmatig vervormen het oppervlak van het schijfje, waardoor slechts een deel van het gezichtsveld voor de beeldvorming in de focus. Om dit te voorkomen, zijn plakken vast aan de opname kamer met behulp van polyethyleenimine (PEI). Bereid de PEI-oplossing (1 ml polyethyleenimine oplossing in 250ml boor-buffer (tabel 4)). Zorg ervoor dat de PEI geheel is opgelost (roer 's nachts). Vul de opname kamers met PEI oplossing zodat de bodem bedekt is met vloeistof ten minste een uur voordat u de plakjes toe te passen Was de opname kamers met gedestilleerd water en vervolgens met r-ACSF van het bedrijf kamer. Overdracht van een slice in een opname kamer. Verwijder de r-ACSF met een pipet en positie van de slijs in het midden met een kwast. Verwijder de r-ACSF rond het schijfje met behulp van stukken van filterpaper. Voor stabiliteit en hechting, is het belangrijk dat er geen ACSF rond het schijfje niet meer. Pipet ongeveer 0,5-1ml ACSF, afhankelijk van de grootte van de opname kamer, op de slice. ACSF moeten gewoon betrekking hebben op de slice oppervlak. Zet de opname kamer met de slice in een grote vochtige-interface container, geperfuseerd met carbogen, en laat de plakjes herstellen voor ten minste een uur. PEI oplossing 1ml Poly (ethyleenimine) oplossing in 250ml boorzuren buffer 40MM boorzuur 10 mM natriumtetraboraat decahydraat Tabel 4. Recipe PEI oplossing. 6. Imveroudering Calcium-afhankelijke indicator kleurstoffen kunnen worden afgebeeld met behulp van een-of twee-foton microscopie. Gebruik van twee-foton imaging activeert enige indicator kleurstof in het middelpunt volume van de regio van belang, waardoor de hoeveelheid licht verstrooien in het weefsel. Bovendien maakt een betere diepte penetratie van het licht in de slice. Voor functionele imaging calcium gebruiken we een Titanium saffier-laser geleverd door samenhangend gekoppeld aan een Olympus microscoop met een 20x objectief (NA 0,95) en een Trimscope systeem door LaVision Biotec. Het systeem maakt het mogelijk Trimscope kader scannen met 64 beamlets gelijktijdig en is gekoppeld aan een Hamamatsu C9100 EM-CCD-camera voor snelle frame-scanning tarieven. Plaats de opname kamer onder de microscoop en een stabiel perfusie met beeldvorming e-ACSF (1,6 Ca 2 + / 1,5 Mg 2 +-ratio (tabel 2)) verhit tot een meer fysiologische temperatuur van minimaal 30 ° C. Focons in de regio van belang (ROI) met behulp van wit licht verlichting. Vermijd blootstelling van de slice om langer dan noodzakelijk licht. Kies de golflengte, imaging gezichtsveld, het scannen frequentie, pixel dichtheid en extra software-opties van toepassing op het weefsel en biologische signalen die u wilt meten. Voor calcium netwerk imaging met Fura 2-AM we meestal kiezen voor een golflengte van 820nm, een 250×250 um beeldvorming gezichtsveld, een linescanning frequentie van 1200Hz en 2-bij-2 binning. Dit resulteert in een frametime van ongeveer 100ms en dus een imaging frequentie van ongeveer 10Hz. Controleer of uw ROI is scherpgesteld met behulp van een continue scan modus en geselecteerde golflengte van het laserlicht. Pas focus en laser intensiteit aan pixel verzadiging en bleken van uw imago te voorkomen. Maak een timelapse film van uw ROI. We meestal krijgen twee timelapse films van 2000 frames per stuk. Voor cel detectie en identificatie, neem dan een z-stack met behulp van een stapgrootte van 1 micrometer en IMAG e + / 20 um rond je afgebeeld vlak van focus. 7. Representatieve resultaten Succesvolle laden van calcium indicatoren zijn Fura 2-AM in figuur 1 in de ontwikkeling van neocorticale en entorhinale cortex netwerken met behulp van multifoton beeldvorming. Sommige kleurstof is nog steeds aanwezig als achtergrond kleuring in het weefsel, maar cel soma en in sommige gevallen, proximale dendrieten zijn duidelijk zichtbaar en gescheiden van de omringende neuropil. Als het laden niet succesvol was, is zeer weinig cel-specifieke kleuring waargenomen en kleine clusters van kleurstof plekken zijn vaak zichtbaar op het oppervlak plak in de dode membraan puin. In deze screenshots, het netwerk van cellen is duidelijk zichtbaar in een vlak van focus voor gelijktijdige cell imaging. Gebruik van een metalen harp of onvolledige kleven van de slice om de opname kamer kan resulteren in een ongelijke plak oppervlak dat moet worden afgebeeld. 550fig1.jpg "alt =" Afbeelding 1 "/> Figuur 1. Fura 2-AM ester-loaded ontwikkelen neocorticale (A, links) en entorhinale (B, rechts) netwerken. Schaal bars 100 micrometer. Te scheiden neuronen van de astrocyten, co-applicatie van sulforhodamine 101 met Fura 2-AM ester maakt de scheiding van celtypen binnen het netwerk. Figuur 2. Astrocyten etikettering met sulforhodamine 101. Een Co-etikettering van Fura 2-AM ester en sulforhodamine 101. Excitatiegolflengte: 820nm. Foto collectie op PMT's met dichroïde spiegel op 560/70nm voor golflengte scheiding. B Vertegenwoordiger fluorescentie sporen van een neuron (boven) en een astrocyte (onder). Schaal bars 60 sec, AF 10 (au fluo). Figuur 3. FITC-geconjugeerd Lycopersicon esculentum (tomaat) lectine vlekken . Etikettering van microglia en endotheelcellen in de ontwikkeling van de muis hippocampus (A) en oppervlakkige entorhinale cortex (B). Calcium indicator kleurstoffen worden gebruikt om read-out activiteit van meerdere cellen tegelijk in de ontwikkeling van corticale en hippocampus netwerken. Figuur 4. Dynamische calcium transiënten in de hippocampus en corticale netwerken. Film 1: Fura 2-AM ester laden van de muis entorhinale cortex tijdens de tweede week na de geboorte. Klik hier om de film een te bekijken. Film 2: Fura 2-AM ester het laden van de muis hippocampus tijdens de eerste postnatale week. Klik hier om de video te bekijken 2. Film 3: Fluo-4 laden van de muis cortex, tijdens de eerste postnatale week. 50movie3.avi "> Klik hier voor filmpje 3 te kijken. In het geval van Fura 2-AM ester, cel activatie met een depolarisatie-geïnduceerde instroom van calcium, vermindert kleurstof fluorescentie. Voor kleurstoffen zoals Fluo-4, het tegendeel is waar en cel depolarisatie wordt waargenomen als een toename van de foton uitstoot. Somatische calcium transiënten zijn voornamelijk gemeten, maar de activiteit in grotere proximale dendrieten kan ook worden gezien in sommige bereidingen, zoals te zien in Movie 2. Uitlezen van het netwerk activiteit kan worden gekwantificeerd met behulp van commerciële of in-house software scripts. In ons lab, cel identificatie en netwerk-activiteit wordt gemeten en geanalyseerd in een semi-automatische manier met behulp van in-house code voor Matlab (Mathworks). Figuur 5. Representatieve analyse van gesynchroniseerde calcium transiënten van een zich ontwikkelende corticale netwerk. 3D-weergave van een neuron ( <strong> A) wordt gebruikt om automatisch een neuron masker (B) van een z-stack voor geautomatiseerde detectie neuron. Metingen van calcium transiënten zijn amplitude, de frequentie en # van actieve cellen die kunnen worden gelezen van een enkele neuron data (C). Synchrony tussen verschillende sporen kunnen worden gevisualiseerd met behulp van een raster plot (D).
