أسلوب التصوير الكالسيوم في تطوير شبكات القشرية
Summary
ويمكن قياس النشاط العفوي لتطوير شبكات الخلايا العصبية باستخدام AM – استر أشكال الأصباغ مؤشر الكالسيوم الحساسة. تم الكشف عن التغييرات في الكالسيوم بين الخلايا ، مما يدل تنشيط الخلايا العصبية ، والتغييرات في مضان عابرة مع مؤشر واحد أو اثنين الفوتون التصوير. ويمكن تكييف هذا البروتوكول لمجموعة من الشبكات التي تعتمد على الخلايا العصبية تنمويا<em> في المختبر</em>.
Abstract
وثمة نمط السمة المميزة لنشاط الجهاز العصبي في وضع غير عفوية ، نشاط الشبكة متزامنة. وقد لوحظ نشاط سليمة متزامنة في الحبل الشوكي ، الدماغ ، اللحاء ، الشبكية وفصلها الاستعدادات ثقافة العصبية. خلال فترات من النشاط العفوي ، يزيل الاستقطاب الخلايا العصبية لاطلاق النار واحد أو رشقات نارية من إمكانات العمل ، وتفعيل قنوات أيونات كثيرة. الاستقطاب تنشيط قنوات الكالسيوم الجهد على بوابات التشعبات والأشواك التي تتوسط تدفق الكالسيوم. وقد تم قياس النشاط الكهربائي المتزامن للغاية من الشبكات العصبية المحلية باستخدام أقطاب الحقل. تمكن هذه التقنية ارتفاع معدلات أخذ العينات الزمانية المكانية ولكن القرار يرجع إلى انخفاض قراءة متكاملة من الخلايا العصبية في واحدة متعددة القطب. قرار وحيد الخلية من نشاط الخلايا العصبية من الممكن استخدام التصحيح ، المشبك على الخلايا العصبية الكهربية واحدة لقياس النشاط اطلاق النار. ومع ذلك ، هو محدود القدرة على قياس من شبكة لعدد الخلايا العصبية ليالي مصححةimultaneously ، وعادة ما يكون احد أو اثنين فقط الخلايا العصبية. وقد مكن استخدام الكالسيوم التي تعتمد على الأصباغ الفلورية مؤشر قياس النشاط متزامنة عبر شبكة من الخلايا. هذا الأسلوب يعطي كلا قرار مكانية عالية وأخذ العينات الزمنية كافية لتسجيل النشاط العفوي للشبكة النامية.
ومن السمات الرئيسية لتشكيل شبكات حديثا القشرية والحصين خلال التنمية قبل وبعد الولادة المبكرة هي عفوية ، وتزامن نشاط الخلايا العصبية (كاتس و Shatz ، 1996 ؛ Khaziphov وLuhmann ، 2006). ويعتقد ان هذا النشاط شبكة مترابطة لأنها ضرورية لتوليد الدوائر الوظيفية في الجهاز العصبي النامي (سبيتزر ، 2006). الرئيسيات في كل من الدماغ والقوارض ، ويلاحظ والكهربائية في وقت مبكر وموجات شبكة الكالسيوم قبل وبعد الولادة ، والمجراة في المختبر (Adelsberger وآخرون ، 2005 ؛. Garaschuk وآخرون ، 2000 ؛. Lamblin وآخرون ، 1999). هذه أنماط النشاط في وقت مبكر ، والتي هي معروفة للسيطرة على عدةالعمليات التنموية بما في ذلك الخلايا العصبية synaptogenesis ، والتمايز واللدونة (راكيتش وKomuro ، 1995 ؛. سبيتزر وآخرون ، 2004) هي من الأهمية الحاسمة للتنمية الصحيحة ونضوج الدوائر القشرية.
إن الرب في هذا الفيديو ، ونحن لشرح الطرق المستخدمة في النشاط صورة عفوية في تطوير شبكات القشرية. الكالسيوم المؤشرات الحساسة ، مثل Fura استر 02:00 ، منتشر عبر غشاء الخلية داخل الخلايا حيث يشق على النشاط استريز AM استرات لمغادرة شكل خلية impermeant صبغة المؤشر. شكل impermeant مؤشر مجموعات حمض الكربوكسيلية التي هي قادرة على الكشف عن ثم ربط أيونات الكالسيوم intracellularly.. يتم تبديل عابر في مضان من الكالسيوم صبغة حساسة على الربط إلى الكالسيوم. وتستخدم تقنيات التصوير واحد أو متعدد الفوتون لقياس التغيير في الفوتونات المنبعثة من الصبغة ، وتبين بالتالي تغيير في الكالسيوم داخل الخلايا. وعلاوة على ذلك ، فإن هذه الكالسيوم دويمكن الجمع بين المؤشرات ependent مع علامات أخرى للتحقيق الفلورسنت أنواع الخلايا النشطة داخل الشبكة.
Protocol
1. صنع شرائح أفقية الدماغ الأنفية الداخلية ، الحصين تصنع شرائح الدماغ الحصين الأنفية الداخلية ، باستخدام أدلة التشريحية ، في لمحة مفصلة 3D في المنطقة وفقا لWouterlood ، كانتو ويتر (2008) اللدونة العصبية رقم 381243 9. جعل 500ml من حل شريحة ، الأوكسجين مع غاز كربوجين (95 الأوكسجين ٪ ، 5 ٪ ثاني أكسيد الكربون) ما لا يقل عن 20 دقيقة ومن ثم تجميد 250ml حتى المثلج. قبل دقائق من تشريح ، سحق الجليد ومزج مع شريحة المتبقية 250ml محتدما حل شريحة لاستخدامها في تشريح وتقطيع في غرفة التشريح. جعل 200ml من R – ACSF (استرداد ACSF) وعلى الأقل 500ml من البريد ACSF (التجريبية ACSF) حل. الأوكسجين بشكل مستمر مع كل من حلول الغاز كربوجين (95 الأوكسجين ٪ ، 5 ٪ ثاني أكسيد الكربون) ما لا يقل عن 20 دقيقة قبل إعداد الأنسجة. هذا البروتوكول ساري المفعول بالنسبة للفئران من يوم بعد الولادة 0 لمدة أقصاها 3 أسابيع من العمر. قطع رأس أنيمال ، وفقا لإجراءات اللجنة المحلية الأخلاقية ، وتشريح خارج الدماغ بسرعة في طبق بتري تحتوي على الجليد الباردة حل شريحة أعدت في الخطوة 1 أعلاه (انظر الجدول رقم 1 لإيجاد حلول والكواشف). الدماغ نقل على ورقة تصفية المنقوع مع حل شريحة وفصل نصفي الكرة الأرضية مع شفرة حلاقة حادة. نقل أحد نصف الكرة مرة أخرى في الجليد الباردة حل شريحة. إزالة المخيخ في نصف الكرة الأرضية الآخر. الوجه الدماغ على خط الوسط وقطع الجزء العلوي من الدماغ مع زاوية طفيف في نهاية منقاري. الوجه الدماغ على خفض (ظهرية) السطحية والغراء وضعها على حامل أنسجة تقطيع رأسا على عقب عن طريق دفع بلطف مع برعم القطن. شريحة 300 ميكرون شرائح سميكة الدماغ باستخدام التردد المنخفض والسرعة في ما تبقى من الجليد الباردة حل شريحة المحرز في الخطوة 1. في ظل ظروف لدينا ، ونحن استخدام فيشر الحرارية العلمية vibratome (Microm ، HM 650V) في ضبط 0.05 ملم / ثانية و36Hz. كماحالما يتم قطع شريحة ونقل ذلك إلى صاحب شريحة (المغمور) التي تحتوي على الاوكسيجين السائل الشوكي الدماغي الاصطناعي (ACSF) (2 + 2.5mM المغنيسيوم ، 1.6mM كا 2 + ، انظر الجدول 2) في درجة حرارة الغرفة. والتركيز العالي في المغنيسيوم R – ACSF يقلل من تدفق الكالسيوم إلى الخلايا العصبية عن طريق مستقبلات NMDA التالية في تشريح وتجربتنا ، ويؤدي إلى تحسين نوعية شرائح للتجارب. إذا لزم الأمر ، وقطع نصف الكرة المخية second بعد ذلك. ترك شرائح لمدة ساعة واحدة لاسترداد. حل شريحة (مم) — 10 110 كلوريد الكولين 25 NaHCO 3 11.6 11.6 10 D – غلوكوز 7 MgCl 2 3.1 sodiumpyruvate 2.5 بوكل 1.25 ناه 2 ص 4 0.5 CaCl 2 الجدول رقم 1 وصفة للحل شريحة. ACSF (مم) 125 كلوريد الصوديوم 26 NaHCO 3 10 D – غلوكوز 3 بوكل 2.5/1.5 MgCl 2 (استرداد / التجربة) 1.6 CaCl 2 1.25 ناه 2 ص 4 الجدول 2 وصفة لكلا الاسترداد (R – ACSF) والتجريبية حل (البريد ACSF). 2. إعداد الفصل تلطيخكهرمان لتحميل الخلايا التي تحتوي على الكالسيوم التي تعتمد على مؤشر أو علامة خلية محددة ، وشرائح تحتاج إلى نقلها إلى غرفة لإجراء تلطيخ. على الرغم من أن الغرف التجارية قد تكون متاحة ، ويمكن للمرء أن يكون من السهل تجميعها من معدات المختبر القياسي لتكلفة قليلة جدا. الملامح الرئيسية لهذه الغرفة هي أن درجة حرارة شرائح الى ما بين 30 و 35 درجة مئوية ، وحضنت في وسط الاوكسيجين بشكل مستمر وهذا هو محمية الغرفة بعيدا عن الضوء. باستخدام قضبان ساخنة ، وجعل ثقب صغير في جدار جانب اثنين من البوليسترين القابل للتصرف أطباق بتري (35 وقطرها 100mm) التي هي كبيرة بما يكفي للسماح للمقطع من أنبوب السيليكون (تقريبا قطرها 1.5mm) بالمرور. الصفحات أنابيب السيليكون من خلال ثقب في طبق بتري الصغيرة وشكل حلقة داخل الجدار الداخلي للصحن صغير. استخدام superglue لاغلاق نهاية مفتوحة للأنابيب وعصا لبقية الأنابيب إلى الجدار الداخلي للصحن بتري. </li> باستخدام إبرة ، وجعل ثقوب دقيقة على فترات متباعدة بشكل متساو ، في أنابيب داخل طبق بتري الداخلية. الغراء طبق بتري أصغر داخل أكبر ، مع كل من الثقوب الانحياز. الصفحات الطرف الآخر من الأنبوب السيليكون من خلال ثقب في جدار الصحن أكبر بتري. للصحن واجهة ، وأخذ خلية إدراج الثقافة بشكل جيد مع غشاء شبه منفذ واستخدام مشرط ساخنة ، وقطع رأس 1cm بعيدا لمغادرة طبق ضحل لعقد شرائح أثناء الحضانة. على غطاء طبق بتري أكبر ، وجعل ثقب تقريبا. 0.5 – 1cm قطر للسماح كربوجين (95 ٪ O 2 ، 5 ٪ CO 2) في التدفق إلى الغرفة. أخذ حقنة 10ML 5 أو البلاستيك. باستخدام مشرط ساخنة ، إجراء خفض الزاوية لإزالة نهاية حقنة والحفاظ على قليل من سم طول أنبوب المحقنة مع طرف. superglue به ، نعلق على سطح قطع من أنبوب المحقنة إلى غطاء طبق بتري ، عبر ثقب قطره 0.5 – 1cm. نعلق أنبوب السيليكون وعلىubing موصل إلى الطرف المحاقن. إرفاق آخر موصل أنابيب لأنابيب السيليكون دخول قاعدة أطباق بتري. ربط الأنابيب ليصل كلا منظم لكربوجين (95 ٪ O 2 ، 5 ٪ CO 2) العرض. مكان الغرفة تلطيخ على طبق ساخن لحضانة بين 30-35 درجة مئوية. ويمكن ضمان تجنيب الغرفة بعيدا عن الضوء أثناء عملية حضانة بأكمله. غرفة تلطيخ جاهز الآن لتجميع واستخدام شريحة الحضانة. منهجية الشكل 1. المقطع العرضي للغرفة الحضانة تلطيخ عرض شريحة (أعلاه) وتطبيق مؤشر الكالسيوم الحساسة (pipetted الاخضر صباغة ، أدناه). 3. تلون شرائح أي التي تنطوي على التعامل مع جميع أنحاء الأصباغ الفلورية ، وتجنب photobleaching من خلال العمل مع القليل من الضوء والحفاظ على الصبغة و tانه نسيج ملون في الظلام بين المناولة. وضعت غرفة تلطيخ على طبق من الحرارة (35 درجة مئوية) ، لأنه ربط إمدادات الغاز كربوجين وملء مع 1.5ml حوالي R – ACSF من صاحب شريحة. مكان الطبق الواجهة في غرفة التلوين وملء مع ACSF 1ml. ضمان إمدادات كربوجين جيدة في غرفة تلطيخ للحفاظ على فقاعات ACSF وبمعدل ثابت لطيف. إضافة 9 و 1 ميكرولتر DMSO حمض pluronic ميكرولتر (20 ٪ في محلول المخزون DMSO ، Invitrogen) إلى قارورة من Fura ميكروغرام 50 2 – AM. دوامة المزيج الصبغة لمدة 15 دقيقة. نقل الشرائح في طبق واجهة ماصة الصبغة في R – ACSF مباشرة فوق منطقة قرن آمون والقشرة المخية الأنفية الداخلية في المصالح ، كما هو مبين في الشكل المنهجية 1 (أعلاه) ، وتحقيق تركيز صبغ 50mM النهائي. إغلاق غطاء غرفة تلطيخ واحتضان الصبغة لمدة 20 — 40 دقيقة اعتمادا على عمر الحيوان (انظر الجدول 3). غير المشبعةفر الشرائح مرة أخرى إلى حامل شريحة. العمر (يوما بعد الولادة) فترة حضانة (دقيقة) <P8 20 P8 – P9 25 P10 – P11 30 P12 – 13 35 > p13 40 الجدول 3. الأوقات الحضانة لمختلف الأعمار ، تجريبيا ، مصممة في المختبر. 4. الأصباغ وغيرها من الأنسجة القديمة ربما بسبب زيادة تكون الميالين في أنسجة المخ ، وشرائح من كبار السن القوارض لا يستغرق Fura 2 – AM استر بهذه السهولة. لتسهيل استيعاب هذه الصبغة يستخدم خطوة حضن مسبق به Cremophor EL (سيغما) لأدمغة الفئران في P13 وكبار السن 11. Cremophor هو السطحي غير الأيونية تستخدم كسواغ في العديد من صيدليةبن التطبيقات. من دون هذه الخطوة ، نجد أن الخلية الخاصة وسم فقيرة للغاية وغير متناسقة في جميع أنحاء شريحة القشرية. نقل الشرائح القديمة إلى حضن مسبق طبق الضحلة مليئة 3ml R – ACSF و 8 ميكروليتر cremophor 0.5 ٪ (سيغما) تسخينها إلى 35 درجة مئوية لمدة 3 دقائق. نقل الشرائح في طبق واجهة واتبع الإجراء تلطيخ العادي (الخطوات 4-7 ، انظر أعلاه). الأصباغ الكالسيوم تحميل كل من الخلايا العصبية وغير العصبية في إعداد شريحة. لتحديد والتمييز بين هذين النوعين من الخلايا داخل الشبكة ، يمكن استخدام sulforhodamine 101 (SR101) لتسمية الخلايا النجمية داخل شريحة. تلون لشرائح sulforhodamine 101 اتبع الخطوات 1-3 كما كان من قبل (القسم 3). 1 اتخاذ ميكرولتر من محلول المخزون 10MM من sulforhodamine (سيغما) من تخزينها في -20 درجة مئوية ، وتذوب في ميكرولتر 999 R – ACSF لإعطاء حل 10 ميكرومتر. ماصة للصبغة أرجوانية اوفإيه الشرائح كما كان من قبل (الخطوات 5-7) ، وترك شرائح يحتضنها لمدة 15 دقيقة. وصفت الخلايا الدبقية الصغيرة والخلايا البطانية باستخدام صبغة FITC lectin الطماطم اتبع الخطوات 1-3 كما كان من قبل. يستغرق 25 ميكرولتر من 2mg/ml Lycopersicon esculentum (الطماطم) lectin FITC المتقارن (L0401 ، سيغما) في محلول المخزون 2.5ml R – ACSF لإعطاء 20 ميكروغرام / مل التركيز. ماصة للصباغة على شرائح كما كان من قبل (الخطوات 5-7) ، وترك شرائح يحتضنها لمدة 45 دقيقة. علما ، فإنه ليس من الممكن الجمع بين هذه الصبغة مع مؤشر الكالسيوم الحساسة مثل Fura 2 صباحا أو أوريغون الخضراء BAPTA – 1 سوف تنبعث (OGB – 1) الذي يتألق في النطاق الأخضر من الطيف منذ الفوتونات من كل من الأصباغ في موجات متداخلة. ومع ذلك ، هناك غيرها من الكالسيوم مؤشر الأصباغ مثل البرتقال الكالسيوم ، Fura الأحمر التي يمكن أن تستخدم في تركيبة مع مرشحات مناسبة أو تقارن lectin تكساس الأحمر إلى الجمع بين الطرافةح الكالسيوم مؤشر الأصباغ في الطيف الخضراء. 5. ربط شرائح لغرفة تسجيل شرائح التصوير خلال الحاجة إلى أن تكون مستقرة تحت المجهر. وعادة ما يتم وضع القيثارة المعدن باستمرار الأنسجة ولكنها يمكن أن تشوه بشكل غير متساو على سطح شريحة ، وإعطاء سوى جزء من مجال الرؤية للتصوير في التركيز. لتجنب هذا الأمر ، عالقون شرائح إلى غرفة تسجيل باستخدام Polyethylenimine (PEI). إعداد الحل PEI (1ml حل Polyethyleneimine العازلة في البوريك 250ml (الجدول 4)). تأكد من أن يذوب تماما PEI (يقلب بين عشية وضحاها). ملء الغرف مع تسجيل حل PEI بحيث يتم تغطية الجزء السفلي مع السائل على الأقل قبل ساعة واحدة تريد تطبيق شرائح غسل غرف تسجيل مع الماء المقطر وبعد ذلك مع R – ACSF من غرفة القابضة. نقل شريحة واحدة في غرفة تسجيل. إزالة R – ACSF مع ماصة وموقف SLالجليد في منتصف باستخدام الفرشاة. إزالة R – ACSF حول شريحة باستخدام قطعة من filterpaper. من أجل الاستقرار والالتزام ، من المهم أن لا ACSF حول شريحة بعد الآن. ماصة ما يقرب من 0.5 1ml ACSF ، اعتمادا على حجم غرفة التسجيل ، وعلى شريحة. وينبغي أن تغطي فقط ACSF سطح شريحة. وضعت غرفة تسجيل مع شريحة في وعاء كبير واجهة مرطب ، مع perfused كربوجين ، والسماح للشرائح استرداد ما لا يقل عن ساعة واحدة. PEI الحل 1ml بولي (ethyleneimine) حل في المخزن البوريك 250ml 40mM حمض البوريك 10MM بورات ثنائي الصوديوم decahydrate الجدول 4. حل صفة PEI. 6. ايمشيخوخة ولا يمكن تصوير الكالسيوم مؤشر الأصباغ التي تعتمد على استخدام إما واحد أو اثنين الفوتون المجهري. استخدام اثنين من الفوتون التصوير ينشط فقط صبغ مؤشر حجم التنسيق داخل المنطقة من الفائدة ، وبالتالي تقليل كمية الضوء المبعثر في الأنسجة. وعلاوة على ذلك ، فإنه يمكن اختراق أفضل عمق الضوء على شريحة. وظيفية للتصوير الكالسيوم نستخدم الياقوت التيتانيوم الليزر التي تقدمها بالإضافة إلى المتماسك المجهر أوليمبوس مع الهدف 20X (NA 0.95) ونظام Trimscope بواسطة بيوتيك LaVision. نظام المسح Trimscope تمكن الإطار مع 64 في نفس الوقت وbeamlets مقرونا الكاميرا هاماماتسو EM – CCD C9100 بالنسبة لمعدلات الإطار مسح سريع. تسجيل موقف الغرفة تحت المجهر ، وإقامة نضح مستقرة مع التصوير الإلكترونية ACSF (1.6 نسبة الكالسيوم + 2 + / 2 1.5 ملغ (الجدول 2)) تسخينها إلى درجة حرارة أكثر من 30 الفسيولوجية أدنى درجة مئوية. FOCلنا في المنطقة ذات الاهتمام (ROI) باستخدام الإضاءة البيضاء الخفيفة. تجنب تعريض شريحة الضوء أطول من اللازم. اختيار الطول الموجي ، وحقل التصوير من عرض ، وتكرار المسح ، وكثافة بكسل وخيارات البرامج الإضافية المطبقة على الأنسجة والإشارات البيولوجية التي ترغب في التدبير. شبكة للتصوير الكالسيوم مع Fura 2 – AM نختار عادة طول موجة من 820nm ، والتصوير ميكرومتر 250×250 مجال الرؤية ، تردد linescanning من 1200Hz وbinning – 2 – 2 من قبل. هذه النتائج في frametime من حوالي 100ms ، وبالتالي تردد حول التصوير من 10Hz. معرفة ما اذا كان العائد على الاستثمار الخاص بك هو في التركيز باستخدام وضع المسح المستمر والطول الموجي مختارة من laserlight. ضبط التركيز وشدة الليزر لتجنب التشبع بكسل وتبييض الصورة. صنع فيلم timelapse من عائد الاستثمار. نكتسب عادة أفلام timelapse اثنين من إطارات 2000 لكل منهما. الكشف عن خلية وتحديد الهوية ، يأخذ ض المكدس باستخدام stepsize من 1 ميكرون وايماج ه + / 20 ميكرون حول الطائرة الخاصة بك تصوير من التركيز. 7. ممثل النتائج التحميل بنجاح المؤشرات الكالسيوم ، وترد Fura 2 صباحا في الشكل 1 في تطوير شبكات القشرة المخية الأنفية الداخلية والقشرة المخية الحديثة باستخدام التصوير multiphoton. بعض الصبغة لا تزال موجودة وتلوين الخلفية في سوما أنسجة الخلايا ولكن في بعض الحالات ، التشعبات القريبة مرئية بوضوح ومنفصلة عن المناطق المحيطة neuropil. إذا لم يتم تحميل بنجاح ، لوحظ القليل جدا من خلايا محددة تلطيخ ومجموعات صغيرة من الصبغة وغالبا ما تكون بقع واضحة على سطح شريحة الحطام في الغشاء القتلى. في هذه الصور ، وشبكة من الخلايا واضحة تماما في طائرة واحدة من التركيز لتصوير الخلايا في وقت واحد. ويمكن استخدام المعدن أو القيثارة الشائكة ناقصة من شريحة إلى غرفة تسجيل النتيجة في سطح شريحة متفاوتة ليمكن تصوير. 550fig1.jpg "بديل =" الشكل 1 "/> الشكل 1. Fura 2 – AM استر محملة النامية القشرة المخية الحديثة (A ، يسار) وشبكات الأنفية الداخلية (B ، يمين). قضبان مقياس 100 ميكرون. لفصل الخلايا العصبية من الخلايا النجمية ، وشارك في التطبيق من 101 sulforhodamine مع Fura 2 – AM استر يمكن الفصل بين أنواع الخلايا داخل الشبكة. الشكل 2. وسم نجمية مع sulforhodamine 101. شارك في وضع العلامات على Fura 2 – AM استر وsulforhodamine 101. موجة الإثارة : 820nm. جمع الصورة على مرآة مع فرق إدارة المشاريع PMT في 560/70nm مزدوج اللون الطول الموجي للانفصال. باء اثار الممثل مضان من الخلايا العصبية (أعلاه) ونجمية ملف (أدناه). مقياس القضبان 60 ثانية ، ΔF 10 (fluo الاتحاد الافريقي). الشكل 3. FITC ، مترافق Lycopersicon esculentum تلطيخ lectin (الطماطم) . وسمها الخلايا الدبقية الصغيرة والخلايا البطانية في تطوير الحصين الماوس (A) والقشرة المخية الأنفية الداخلية سطحية (B). وتستخدم الأصباغ الكالسيوم مؤشر للقراءة من النشاط من خلايا متعددة في نفس الوقت في تطوير الشبكات القشرية والحصين. الشكل 4. العابرين الكالسيوم دينامية في قرن آمون والشبكات القشرية. فيلم 1 : 2 – AM Fura تحميل استر من الماوس القشرة الشمية الداخلية خلال الأسبوع ما بعد الولادة الثانية. انقر هنا لعرض الفيلم 1. الفيلم 2 : 2 – AM Fura تحميل استر الحصين الماوس خلال الأسبوع ما بعد الولادة الأولى. انقر هنا لعرض الفيلم 2. فيلم : 3 – 4 Fluo تحميل القشرة الماوس ، خلال الأسبوع ما بعد الولادة الأولى. 50movie3.avi "> اضغط هنا لمشاهدة فيلم 3. في حالة Fura 2 – AM التنشيط استر الخلية ، التي تنطوي على إزالة الاستقطاب الناجم عن تدفق الكالسيوم ، ويقلل صبغ مضان. لمثل الأصباغ Fluo – 4 ، والعكس هو الصحيح ، وكما لاحظ الخلية الاستقطاب زيادة في انبعاثات الفوتون. تقاس أساسا العابرين الكالسيوم جسدية ولكن يمكن أيضا النشاط في التشعبات أكبر الداني أن ينظر إليها في بعض الاستعدادات ، كما هو مبين في الفيلم 2. يمكن قراءة كميا من نشاط الشبكة باستخدام البرامج النصية البرمجيات التجارية أو في منزل. لدينا مختبر في تحديد الخلية ، ونشاط الشبكة وتحليلها ويقاس بطريقة شبه الآلي في المنزل باستخدام رمز لمطلب (Mathworks). الشكل 5. ممثل تحليل الكالسيوم العابرين متزامنة من شبكة القشرية النامية. 3D التمثيل من عصبون ( <strاونج> A) تستخدم تلقائيا لإنشاء قناع الخلايا العصبية (B) من ض المكدس للكشف عن الخلايا العصبية الآلي. قياسات العابرين الكالسيوم تشمل السعة والتردد وعدد الخلايا النشطة التي يمكن أن تقرأ البيانات من الخلايا العصبية واحد (C). يمكن التزامن بين آثار مختلفة تصور باستخدام مؤامرة النقطية (D).
Discussion
الأساليب نظهر هنا تظهر بروتوكولات مناسبة لتصوير الكالسيوم ديناميات شبكة من خلايا محددة ضمن تطوير شبكات القشرية وقرن آمون في الماوس ، وكذلك في الدماغ الفئران. هذه الأساليب تقديم القرار المكاني الأمثل لتصور شبكة محلية في وقت واحد من الخلية somas لقياس النشاط suprathreshold. ويمكن تغيير القرار الزمني للنشاط الشبكة ، اعتمادا على الإطار إعدادات اقتناء كاميرا CCD ، لتحسين إشارة : قياسات الضوضاء لفترة طويلة أحداث suprathreshold المدة ، والتي توجد عادة في الجهاز العصبي النامي. لا تقتصر هذه البروتوكولات للشبكات قرن آمون ولكن أيضا الخلايا القشرية التسمية في جميع أنحاء النظام العصبي النامي. الحد من هذه الطريقة هي التي يمكن تسجيلها فقط suprathreshold النشاط.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ويدعم العمل في المختبر بواسطة Organisatie Nederlandse Onderzoek Wetenschappelijk voor (NWO) (917.10.372) إلى RMM. ويتبع دينار لبرنامج الاتحاد الاوروبي FP7 BrainTrain ( www.brain – train.nl ). نشكر بيتر لورنس ، وسابين Baljon شميتز (سواء CNCR ، VU جامعة أمستردام) للصور من مجموعة multielectrode FP الطول الموجي والثقافات العصبية المستخدمة في تسلسل الفيديو.
Materials
| Solutions | |||
| CaCl2 | Sigma Aldrich | 22,350-6 | |
| Choline chloride | Sigma | C7527 | |
| cremaphor | Fluka | 27963 | Cremophor EL® |
| DMSO (Dimethyl sulfoxide) | Sigma Aldrich | 472301 | |
| D-glucose | Sigma Aldrich | 16325 | |
| Fura-2 AM | Invitrogen | F-1221 | special packaging |
| KCl | Sigma Aldrich | 60130 | |
| MgCl2 | Fluka | 63072 | |
| NaCl | Sigma Aldrich | 31434 | |
| NaHCO3 | Sigma Aldrich | 31437 | |
| NaH2PO4 | Merck | 106346 | |
| Pluronic® F-127 | Invitrogen | P-3000MP | 20% solution in DMSO |
| sodium ascorbate | Sigma | A7631 | |
| sodium pyruvate | Sigma Aldrich | P2256 | |
| Lectin from Lycopersicon esculentum (tomato) | Sigma | L0401 | |
| Sulforhodamine 101 acid chloride | Sigma | S3388 | |
| Poly(ethyleneimine) solution | Fluka | P3143 | |
| boric acid | Sigma | B6768 | |
| Sodium tetraborate decahydrate | Sigma | B3545 | |
| PEI | |||
| Staining chamber | |||
| Syringe (5 or 10 ml) | Terumo | with luer lock | |
| Cell Culture Inserts for 6-well plates, 8.0 µm, transparent PET membrane | BD Falcon™ | 353093 | |
| Petri dish (35 and 100mm) | disposable, polystyrene | ||
| tubing and connectors | |||
| super glue | |||
| Holders and Chambers | |||
| Slice holder | submerged | ||
| Staining chamber | interface chamber | ||
| recording chamber | e.g. MEA probes | ||
| Imaging setup | |||
| Titanium Sapphire laser (Chameleon) | Coherent | ||
| Trim Scope | LaVision | 64 beams | |
| Microscope | Leica | High NA lense |
References
- Katz, L. C., Shatz, C. J. Synaptic activity and the construction of cortical circuits. Science. 274, 1133-1138 (1996).
- Khazipov, R., Luhmann, H. J. Early patterns of electrical activity in the developing cerebral cortex of humans and rodents. Trends in Neurosciences. 29, 414-418 (2006).
- Spitzer, N. C. Electrical activity in early neuronal development. Nature. 444, 707-712 (2006).
- Adelsberger, H., Garaschuk, O., Konnerth, A. Cortical calcium waves in resting newborn mice. Nat. Neurosci. 8, 988-990 (2005).
- Garaschuk, O., Linn, J., Eilers, J., Konnerth, A. Large-scale oscillatory calcium waves in the immature cortex. Nat. Neurosci. 3, 452-459 (2000).
- Lamblin, . Electroencephalography of the premature and term newborn. Maturational aspects and glossary. Neurophysiol. Clin. 29, 123-219 (1999).
- Rakic, P., Komuro, H. The role of receptor/channel activity in neuronal cell migration. J. Neurobiol. 26, 299-315 (1995).
- Spitzer, N. C., Root, C. M., Borodinsky, L. N. Orchestrating neuronal differentiation: patterns of Ca2+ spikes specify transmitter choice. Trends. Neurosci. 27, 415-421 (2004).
- Canto, C. B., Wouterlood, F. G., Witter, M. P. What does the anatomical organization of the entorhinal cortex tell us. Neural. Plast. , 381243-381243 (2008).
- Bureau, I., Shepherd, G. M., Svoboda, K. Precise development of functional and anatomical columns in the neocortex. Neuron. 42, 789-801 (2004).
- Ikegaya, Y., Le Bon-Jego, M., Yuste, R. Large-scale imaging of cortical network activity with calcium indicators. Neuroscience research. 52, 132-138 (2005).
Tags
Functional Calcium ImagingDeveloping Cortical NetworksSynchronized Network ActivitySpontaneous ActivityDepolarizationVoltage-gated Calcium ChannelsSynchronized Electrical ActivityField ElectrodesPatch-clamp ElectrophysiologyCalcium-dependent Fluorescent Indicator DyesSpatial ResolutionTemporal Sampling
Cite This Article
Dawitz, J., Kroon, T., Hjorth, J. J., Meredith, R. M. Functional Calcium Imaging in Developing Cortical Networks. J. Vis. Exp. (56), e3550, doi:10.3791/3550 (2011).