توصيف بالسكان خلية كهربية من GFP - يعرب عن السليمة في الشبكية
Summary
هذا المقال يصور تسجيل الخلايا العصبية الفردية من السكان الموسومة fluorescently في الشبكية الماوس سليمة. باستخدام اثنين الفوتون الإثارة الأشعة تحت الحمراء تم استهداف الخلايا المسمى transgenetically عن التصحيح ، المشبك تسجيل لدراسة ردودهم الخفيفة ، وخصائص الحقل تقبلا ، والتشكل.
Abstract
دراسة الخصائص الفيزيولوجية واتصالات متشابك معينة من الخلايا العصبية في أنسجة سليمة يشكل تحديا لتلك الخلايا التي تفتقر إلى السمات المورفولوجية واضح أو إظهار كثافة السكانية المنخفضة. هذا ينطبق بشكل خاص على الخلايا الشبكية عديم الاستطالات ، وهي فئة استثنائية في interneurons المتعددة الأشكال والتي تضم ما يقرب من 30 في الثدييات فرعية 1. على الرغم من كونها جزءا مهما من معالجة البصرية من خلال وضع الإخراج الشبكية 2 ، لم تكن معظم هذه الأنواع الفرعية درست حتى الآن في سياق وظيفي لمواجهة هذه الخلايا مع القطب تسجيل هو حدث نادر.
في الآونة الأخيرة ، عدد كبير من خطوط الماوس المعدلة وراثيا التي تتوفر علامات التعبير عن بروتين فلوري مثل الفلورسنت الأخضر (GFP) تحت سيطرة المروجين لمستقبلات الغشاء أو الانزيمات التي هي محددة لمجموعة فرعية فقط من الخلايا العصبية في نسيج معين 3،4. هذه الخلايا ما قبل المسمى بالتالي فهي accessibl ه لتوجيه microelectrode استهداف تحت السيطرة المجهرية ، والسماح للدراسة منهجية خصائصها الفسيولوجية في الموقع. ومع ذلك ، ويرافق إثارة علامات الفلورسنت من خطر الضيائية للأنسجة الحية. في شبكية العين ، ويعوق هذا النهج بالإضافة إلى المشكلة التي تسبب الإثارة ضوء التحفيز المناسب للمبصرات مما كبد صباغ متبدل بالضوء تبيض ونقل الدوائر الشبكية في حالة الضوء مكيفة. يتم التغلب على هذه العوائق باستخدام الأشعة تحت الحمراء الإثارة التي تقدمها ليزر وضع تخوض نبضات قصيرة من نطاق الفيمتو ثانية. الإثارة ثنائي الفوتون يوفر طاقة كافية لاستثارة fluorophore ، وفي الوقت نفسه يحد من الإثارة إلى وحدة تخزين صغيرة الأنسجة التقليل من مخاطر photodamage 5. أيضا ، فإنه يترك الشبكية تستجيب لمحفزات بصرية منذ ضوء الأشعة تحت الحمراء (> 850 نانومتر) هو ضعيف فقط تمتصه photopigments 6.
<p clasق = "jove_content"> نحن في هذه المقالة لشرح استخدام الفأرة في شبكية العين وراثيا لتحقيق الكهربية في تسجيلات الموقع من GFP ، معربا عن الخلايا التي يتم استهداف بصريا من قبل اثنين من الفوتون الإثارة. مستعدة شبكية العين والمحافظة عليها في الظلام ويمكن أن يتعرض للمؤثرات الضوئية التي يتوقع عبر المكثف من المجهر (الشكل 1). ويمكن الجمع بين التصحيح ، المشبك تسجيل الاستجابات ضوء صبغ مع ملء الكشف عن التشكل وصبغ للتحقق من مفرق بوساطة الفجوة اقتران إلى الخلايا المجاورة ، بحيث يمكن دراستها من قبل الخلية الهدف على مستويات مختلفة التجريبية.Protocol
Discussion
هذا الأسلوب يتيح إمكانية لدراسة الخصائص الكهربائية للخلايا العصبية المحددة في الشبكية سليمة تحت إشراف البصرية دون التأثير على حالة adaptational الشبكية. هي مناسبة خاصة وأنها لتوصيف الخلايا التي هي في الوقت الحاضر بدلا درس سيئة بسبب الكثافة السكانية المنخفضة مثل معظم السكان من الخلايا عديم الاستطالات. ثنائي الفوتون الإثارة تصاريح التصوير عالية الدقة وعالية التباين ، وحتى من أعمق أجزاء من الأنسجة 17 ، شرطا مسبقا لاستهداف دقيقة وناجحة التصحيح – لقط من خلايا خاصة في INL مع كثافة عالية من الهيئات الخلية.
شبكية العين هي معزولة الماوس قابلة للح 3-4 في ظل الظروف التجريبية. إذا تم تخزين شبكية العين الثانية في ظلام دامس تحت بالغاز كربوجين مستمرة ، فإنه يحتفظ اللون الأرجواني من صباغ متبدل بالضوء غير المبيض ، ويمكن استخدامها بعد الانتهاء من التجارب على شبكية العين الأولى. في البداية ، واستهدافالخلية المحددة مع micropipette wholemount في شبكية العين قليلا تحديا ويتطلب بعض الممارسة ، وخصوصا عندما تعمل في الظلام. يمكن بما في ذلك صبغة الفلورسنت في micropipette تبسيط الإجراءات ، وذلك لأن الخلية وmicropipette مرئية تحت ثنائية الفوتون الإثارة في نفس الوقت. ومع ذلك ، قد إضافة مكونات إلى حل بين الخلايا يعرقل تشكيل gigaseal أو التسبب في جودة التسجيل للمعاناة. مرة واحدة حققت بنجاح ، يمكن تسجيل جيدة للمشاركة حوالي 1 ساعة.
في حين أن ضوء الأشعة تحت الحمراء هي سيئة الإثارة فقط استوعبت نفسها مبصرات الشبكية ، متحمس GFP – معربا عن الخلايا ينبعث الضوء في الجزء المرئي من الطيف. ومع ذلك ، نحن متحمسون fluorophores فقط في حجم تنسيق والصغيرة التي ليس من المرجح أن تغير الشرط adaptational من شبكية العين. وهناك حاجة فقط عن أكثر ، والإثارة لاستهداف ويمكن مغلقا خلال تسجيل الاستجابات الخفيفة.
وusefulnويتجلى بالفعل وفاق سطيف لهذا النهج من الدراسات على فئات معينة من السكان من الخلايا التي عديم الاستطالات 14،18 من التسجيلات الكهربية لولاها لكان ممكنا فقط عن طريق الصدفة 12. أخيرا ، يمكن أيضا أن تكون هذه التقنية القوية التي تقدمها بما في ذلك اتباع نهج الدوائية 14 ، كا 2 + 19 أو التصوير باستخدام خلايا حقن للدراسات immunocytochemical أو المجهر الإلكتروني. بهذه الطريقة ، يمكن كشف موقف الوظيفية من نوع خلية معينة في الدوائر الشبكية.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل من قبل جمعية الألمانية للبحوث (WE849/16 1 / 2 الى دينار وRW). ونحن ممتنون ليولر توماس (Töbingen والمانيا) لتحفيز QDS البرامج الخفيفة.
Materials
| Reagent/Equip-ment | Company | Catalogue number | Comments |
|---|---|---|---|
| Night-vision goggles | Gutzeit GmbH, Warthausen, Germany | Xtron F1 | includes a 800 nm light source |
| Optical filter | Schott, Mainz, Germany | RG9 | longpass filter with cutoff at 690 nm |
| Iris scissors | Fine Science Tools | 14061-09 | curved with 22 mm blade |
| Spring scissors | Fine Science Tools | 15000-00 | straight with 3 mm blade |
| Recording chamber | Luigs & Neumann GmbH, Ratingen, Germany | 200-100 500 0180 type A(TC) | Teflon chamber with bottom-mounted glass cover slip (approx. 0.15 mm; No. 200-100 500 0182) |
| Flow heater | Multichannel Systems, Reutlingen, Germany | PH01, TC01 | heatable perfusion cannula with temperature sensor and temperature controller |
| Laser scanning microscope | Leica Microsystems | DM LFS | controlled by Leica Confocal Software |
| Air table | Newport | VH 3036W-OPT | |
| Laser | Spectra-Physics | Tsunami Mode-locked Ti:sapphire laser | |
| CCD camera | pco AG, Kelheim, Germany | PixelFly QE | including control software |
| Micropipette glass capillaries | Hilgenberg, Malsfeld, Germany | 1408411 | |
| Micropipette puller | Sutter Instrument | P-97 | |
| Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A-20004 | fluorescent dye |
| Neurobiotin | Axxora | VC-SP-1120-M050 | non-fluorescent tracer |
| Streptavidin-Cy3 | Dianova | 016-160-084 | |
| Micromanipulator | Luigs & Neumann GmbH, Ratingen, Germany | 210-100 000 0010 | motorized Mini25 manipulator unit with display SM-5 |
| Patch-clamp amplifier | npi electronic GmbH, Tamm, Germany | SEC-05LX npi | |
| Digitizer | National Instruments | BNC-2090 | |
| Data acquisition software WinWCP | John Dempster, University of Scotland, Glasgow, UK | http://spider.science.strath. ac.uk/sipbs/ software.htm | |
| Visual stimulus generator QDS | Thomas Euler, University of Tübingen, Germany | has to be operated on a separate computer controlling 2 monitors (user interface, stimulus monitor) | |
| Neutral density filters | ITOS, Mainz, Germany |
References
- Masland, R. H. The fundamental plan of the retina. Nat. Neurosci. 4, 877-886 (2001).
- Baccus, S. A. Timing and computation in inner retinal circuitry. Annu. Rev. Physiol. 69, 271-290 (2007).
- Haverkamp, S., Inta, D., Monyer, H., Wässle, H. Expression analysis of green fluorescent protein in retinal neurons of four transgenic mouse lines. Neuroscience. 160, 126-139 (2009).
- Siegert, S., Gross-Scherf, B., Del Punta, K., Didkovsky, N., Heintz, N., Roska, B. Genetic address book for retinal cell types. Nat. Neurosci. 12, 1197-1204 (2009).
- Svoboda, K., Yasuda, R. Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience. Neuron. 50, 823-839 (2006).
- Euler, T., Detwiler, P. W., Denk, B. Directionally selective calcium signals in dendrites of starburst amacrine cells. Nature. 418, 845-852 (2002).
- Sakmann, B., Neher, E. . Single-Channel Recording. , (1995).
- Jackson, M. B., Gerfen, C. Whole-cell voltage clamp recording. Current Protocols in Neuroscience. , (1997).
- Majewska, A., Yiu, G., Yuste, R. A custom-made two-photon microscope and deconvolution system. Pfügers Arch. – Eur. J. Physiol. 441, 398-408 (2000).
- Yuste, R., Konnerth, A. . maging in Neuroscience and Development: A Laboratory Manual. , (2005).
- Euler, T., Hausselt, S. E., Margolis, D. J., Breuninger, T., Castell, X., Detwiler, P. B., Denk, W. Eyecup scope – optical recordings of light stimulus-evoked fluorescence signals in the retina. Pflügers Arch. – Eur. J. Physiol. 457, 1393-1414 (2009).
- Wei, W., Elstrott, J., Feller, M. B. Two-photon targeted recording of GFP-expressing neurons for light responses and live-cell imaging in the mouse retina. Nat. Protoc. 5, 1347-1352 (2010).
- Matsushita, N., Okada, H., Yasoshima, Y., Takahashi, N., Kiuchi, K., Kobayashi, K. Dynamics of tyrosine hydroxylase promoter activity during midbrain dopaminergic neuron development. J. Neurochem. 82, 295-304 (2002).
- Knop, G. C., Feigenspan, A., Weiler, R., Dedek, K. Inputs underlying the ON-OFF light responses of type 2 wide-field amacrine cells in TH-GFP mice. J. Neurosci. 31, 4780-4791 (2011).
- Zhang, D. Q., Stone, J. F., Zhou, T., Ohta, H., McMahon, D. G. Characterization of genetically labeled catecholamine neurons in the mouse retina. Neuroreport. 15, 1761-1765 (2004).
- Contini, M., Lin, B., Kobayashi, K., Okano, H., Masland, R. H., Raviola, E. Synaptic input to ON-biploar cells onto the dopaminergic neurons of the mouse retina. J. Comp. Neurol. 518, 2035-2050 (2010).
- Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nat. Methods. 2, 932-940 (2005).
- Dedek, K., Breuninger, T., de Sevilla Müller, L. P., Maxeiner, S., Schultz, K., Janssen-Bienhold, U., Willecke, K., Euler, T., Weiler, R. A novel type of interplexiform amacrine cell in the mouse retina. Eur. J. Neurosci. 30, 217-228 (2009).
- Denk, W., Detwiler, P. B. Optical recording of light-evoked calcium signals in the functionally intact retina. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 7035-7040 (1999).
