Habituación y la inhibición prepulso de sobresalto acústico en roedores

1. Protocolo de Diseño Calibración: Antes de una serie de experimentos, calibrar los altavoces. Esto es importante para que los altavoces mostrar el volumen exacto que se estableció por el experimentador. También calibrar la sensibilidad de la plataforma de transductor de las cajas de sobresalto de acuerdo al manual del proveedor. El transductor convierte el movimiento vertical de la plataforma en una señal de tensión. Asegúrese de que no hay experimentos en marcha en la calibración del sistema, y ​​que todas las cajas están calibrados de la misma manera. i / o Función: Si las nuevas cepas de ratones o ratas se miden, una función de entrada / salida debe ser establecido. Después de un período de aclimatación de unos 5-10 minutos, con un ruido de fondo blanco constante de 65 a 68 dB (ver más abajo), los estímulos de sobresalto (20 ms ruido blanco) se debe mostrar cada 20 seg, a partir de alrededor de 70-75 dB. Intensidad de estímulo de sobresalto se incrementará entre cada estímulo por 2.5 dB hasta llegar a 120-130 dB, lo que resulta en 10 a 30 ensayos con estímulos de sobresalto (ver figura 1). Estructura de protocolo: habituación y la inhibición prepulso se puede medir dentro de un protocolo. El protocolo se divide en un período de aclimatación, un bloque I (habituación), inmediatamente seguido por un bloque II (PPI, figura 2). Antes de medir la inhibición prepulso, los animales siempre deben ser sometidos a la habituación de sobresalto, de modo que atenuaciones sobresalto debido a la habituación no interferir con las mediciones PPI. Período de aclimatación: Cada vez que se prueba un animal, primero se somete a una fase de aclimatación con el fin de adaptarse a la titular de los animales, caja de sobresalto y el ruido de fondo. Durante un período de aclimatación de 5-10 minutos, el ruido de fondo constante de 65-68dB de ruido blanco (dependiendo del ruido del medio ambiente) se muestra, pero sin estímulo de sobresalto. Durante esta fase el animal se calme, se detiene a explorar el entorno y dejar de moverse. Bloque I habituación: Para habituación a corto plazo (STH), entre 30 -100 estímulos de sobresalto se debe aplicar en el fondo. Estímulos de sobresalto son ruidos comúnmente blanco de 20 ms de duración y los tiempos de subida muy pronunciada (0, si es posible). La intensidad está muy bien en el volumen en el que la función de E / S llegaron a la meseta de máxima respuesta de sobresalto, comúnmente en 105 a 115 dB. Los intervalos entre ensayos individuales deben ser siempre 20 segundos o al azar de entre 10 y 30 segundos (véase el análisis y la figura 3). Bloque II inhibición prepulso: Con el fin de medir el PPI, los ensayos con un pulso de sobresalto solo y ensayos con un prepulso son pseudorandomized en el bloque II. El ruido de fondo y el estímulo de sobresalto son los mismos que en el bloque I. El prepulso es un ruido blanco de 4 ms de duración y también el tiempo de subida pronunciada. Dos parámetros pueden ser variados: el intervalo inter-entre prepulso y asustar a pulso y la intensidad de la prepulso (véase la discusión). Nos proponemos utilizar normalmente dos diferentes intensidades prepulso (75 y 85 dB) y dos intervalos interestímulo diferentes (30 ms y 100 ms). Así, hay cuatro diferentes prepulso pulso ensayos más el pulso de sobresalto solo los ensayos para ser pseudorandomized y se muestra 10 veces cada uno, que asciende a 50 ensayos. Inter-ensayo intervalos pueden ser 20 segundos o al azar de entre 10 y 30 segundos (véase la discusión). En algunos casos puede ser beneficioso añadir un sexto tipo de ensayos, que es un juicio prepulso solo (ver la discusión y el gráfico 4). Habituación a largo plazo: el fin de medir LTH, todo el protocolo que se ejecuta en al menos cinco días siguientes. Por otra parte, sólo la fase de aclimatación y el bloque que se puede ejecutar, sin embargo, con el fin de ver LTH, bloque que debe contener al menos asustar a 100 estímulos. La presentación de 30 estímulos por día conduce a la LTH muy poco o nada en la mayoría de los animales, especialmente en los ratones. Ejecuta debe estar en aproximadamente el mismo tiempo de cada día, ya que la respuesta de sobresalto amplitudes varían con el ciclo diurno. 2. Manejo y aclimatación de los animales Existen grandes diferencias en el manejo y la aclimatación de las ratas en comparación con los ratones. Los ratones se colocan en el soporte adecuado de los animales (que no debe ser restringida) por 2-5 minutos con el ruido de fondo, pero sin estímulo de sobresalto (fase de aclimatación del programa). Este procedimiento debe repetirse 3-5 veces, una o dos veces al día, hasta que defecar y orinar en el soporte del ratón cesa o disminuye considerablemente. Los titulares de los animales deben estar siempre sustituir o limpiar después de un animal se retira. Las ratas deben ser manejados por al menos tres sesiones de 17. Al final de las sesiones de manejo de tercero se coloca en un soporte adecuado de los animales (sin limitar) y expuestos a ruido de fondo durante varios minutos. Después de la eliminación de ellos, pueden ser recompensados ​​con semillas de girasol para formar pasociaciones ositive con el procedimiento de prueba. Este procedimiento se repite dos veces más, expandiendo gradualmente el tiempo de aclimatación, antes de todo el protocolo que se ejecuta. Para las pruebas de las sesiones, los animales se colocan en todas las cámaras, las puertas cerradas y el protocolo con la fase de aclimatación, que bloque y bloque II se ejecuta. Si hay diferentes grupos de animales (inyecciones, los genotipos), que debe ser mezclado o al azar en las tandas diferentes y las diferentes cajas. Si un animal es a prueba repetidamente (por ejemplo, con diferentes tratamientos), se debe volver a analizarse en la misma caja. Para repetir las pruebas PPI en ratas, también se recomienda para ejecutar un protocolo completo antes de la recolección de datos se lleva a cabo. PPI con frecuencia mejora entre la primera y la sesión de pruebas segundos (PPI aprendizaje), y se mantiene consistente a partir de entonces. También se eliminará una gran parte de la LTH. 3. Análisis de Datos Habituación a corto plazo: Para el análisis de la habituación a corto plazo, todas las respuestas de sobresalto de bloque que se trazan para cada animal. Si los animales dentro de un grupo tienen similares amplitudes de la respuesta de sobresalto, los valores se pueden promediar entre los animales. En la mayoría de los casos, sin embargo, absoluta amplitudes sobresalto difieren considerablemente entre los animales y los niveles de susto no se distribuyen normalmente. En este caso, es más viable para normalizar los datos de cada animal a su primero, o el promedio de las dos primeras, las respuestas de sobresalto en el bloque I (animales a veces se duermen durante la fase de aclimatación que resulta en una respuesta de sobresalto primero baja y una alta sobresalto segundo). Los datos normalizados se pueden promedio a través de todos los animales con el fin de trazar el curso de la habituación. Para realizar una evaluación cuantitativa de la cantidad de habituación, una puntuación puede ser calculado por cada animal, por ejemplo, el promedio de los últimos 10 respuestas de sobresalto, dividido por el promedio de las dos primeras respuestas (figura 6). La inhibición prepulso: Para el análisis de la inhibición prepulso, los datos del bloque II tiene que ser ordenados en función del tipo de ensayo (por ejemplo, mediante la exportación de todas las columnas de datos relevantes en Excel y ordenar por prepulso intensidad y duración de ISI). Los diez trazas por el tipo de ensayo se promedian, y los valores resultantes de los ensayos prepulso pulsos se dividen por el impulso de sobresalto solo valor, multiplicado por 100. Esto revela la cantidad de sobresalto restante (porcentaje de la base de sobresalto) bajo diferentes condiciones prepulso para cada animal. Línea de base de sobresalto (solo pulso) es del 100%. Estos valores pueden ser promediados a través de los animales de un grupo y se trazan (Figura 7). Por otra parte, la cantidad de PPI se pueden trazar restando la respuesta de sobresalto restante de 100% (Figura 7). Tenga en cuenta: cuando se compara PPI en los diferentes grupos de animales, siempre se debe también informar si existe una diferencia en la línea de base amplitudes de sobresalto, por ejemplo, comparando las amplitudes de sobresalto absoluto de los ensayos de sobresalto pulso solo (o amplitudes de sobresalto en el bloque I) . Habituación a largo plazo: el fin de analizar LTH las dos primeras respuestas del bloque I de cada día se promedian y se representa por encima del mínimo de cinco sesiones consecutivas de pruebas. Esto elimina la posibilidad de que las diferencias en STH afectar el resultado del análisis de LTH. Si se ha establecido que un gen de tratamiento / no afecta STH, en su defecto todas las respuestas en el bloque que puede ser simplemente un promedio para cada día y será dibujado. LTH se puede cuantificar mediante el cálculo de una puntuación de habituación donde 'se divide el valor de los primeros días de los últimos días el valor, multiplicado por 100, por lo que el porcentaje de nivel de sobresalto inicial que queda después de la LTH se muestra. Puntuaciones de habituación puede ser promediados a través de los animales (figura 8). 4. Los resultados representativos: i / o función: Los roedores generalmente empiezan a asustar a partir de un volumen de 85-90 dB en (con 20 ms de duración, el ruido blanco). La respuesta de sobresalto se incrementa con el aumento de volumen y, normalmente, alcanza un máximo a 100-110 dB. Si los animales se apartan considerablemente de estos valores, los animales podrían haber alterado la capacidad auditiva o habilidades motoras. Típicas funciones I / O se muestran en la figura 5. Habituación a corto plazo: las ratas bien manejado normalmente acostumbran a alrededor del 60% de su respuesta de sobresalto inicial, sin embargo, hay enormes diferencias individuales y diferencias de las cepas. El efecto más fuerte habituación se produce normalmente dentro de los varios estímulos en primer lugar. Los ratones suelen habituarse a menos que las ratas (por lo general de alrededor del 80%), pero diferencias de las cepas pueden ser muy grandes. Un curso de habituación típico se muestra en la figura 6. La inhibición prepulso: La mayoría de las ratas muestran PPI de alrededor del 90%, con un óptimo prepulso (85dB, 4 ms, el ruido blanco). PPI es muy robusto y las diferencias individuales son relativamente pequeños con esta configuración experimental. Menor volumen prepulsesrinden menos PPI y una mayor variabilidad (incluso dentro de un animal), sino que también parece ser más vulnerable a las manipulaciones farmacológicas o genéticas. Diferentes resultados PPI se representan en la figura 7. Habituación a largo plazo: a largo plazo habituación se puede observar en varias sesiones de pruebas. LTH es muy robusto en las ratas. En los ratones, que a menudo requiere la presentación de una gran cantidad de estímulos de sobresalto en cada sesión a fin de observar LTH. Los resultados típicos LTH se puede ver en la figura 8. Figura 1. Estímulo protocolo para la función de E / S. Después de un período de aclimatación de 5-10 min. con 65 dB de nivel de presión sonora (SPL) el ruido de fondo y no asustar a los estímulos (no mostrado), 20 ms estímulos ruido blanco se presentan cada 20 seg. La intensidad se incrementa gradualmente desde 75 hasta 130 dB en incrementos de 5 dB (bg el ruido de fondo =). Figura 2. Estructura del Protocolo para la habituación combinado y la medición de PPI. Durante todo el protocolo, un ruido de fondo constante de 65 dB se aplica. Hay un período de aclimatación de 5-10 min. sin ningún estímulo adicional. Inmediatamente después, la habituación se prueba por 30 a 100 estímulos de sobresalto (bloque I, ver figura 3). Esta es seguida inmediatamente por las pruebas PPI (bloque II, véase el gráfico 4). Figura 3. Protocolo de estímulo para la medición de la habituación (bloque I). Un ejemplo típico de un bloque que para las pruebas de habituación a corto plazo se muestra. Se compone de 30 100 pruebas idénticas en el que se presentó un 20 ms 105 dB de ruido blanco, con un tiempo de subida 0 con un intervalo entre ensayos (ITI) de 20 seg. Las variaciones de este protocolo puede incluir una mayor intensidad de estímulo de sobresalto o SIIT variables Figura 4. Protocolo de estímulo para la medición de PPI (bloque II). Un ejemplo de una parte típica de un bloque II para las pruebas de PPI se muestra. Bloque II se compone de 5-6 tipos de prueba diferentes que se presentan 10 veces en cada una orden pseudorandomized. Aquí, dos diferentes intensidades prepulso (75 dB y 85 dB) y dos intervalos diferentes interestímulo (ISIS, 30 y 100 ms) se ponen a prueba. Estímulo de sobresalto solo pruebas y ensayos prepulso solo se entremezclan. Este bloque habría 6×10 = 60 ensayos. Prepulses son 4 ms pulsos de ruido blanco, con tiempo de subida 0. Las variaciones de este protocolo consiste en SIIT variable, mayor intensidad de estímulo de sobresalto, diferentes intensidades de prepulso y / o duraciones y diferentes ISI entre prepulso y pulso. Figura 5. Ejemplo de una función de E / S. Las curvas de entrada / salida de 11 ratones individuales de la misma cepa se muestran en gris. En este caso, las amplitudes varían considerablemente de sobresalto (las respuestas de sobresalto en unidades arbitrarias). La línea de color negro sólido se muestra el promedio de las amplitudes de sobresalto y los errores típicos en las diferentes intensidades de estímulo de sobresalto. Estos ratones alcanzaron su máxima respuesta de sobresalto en alrededor de 105 dB. Figura 6. Ejemplo de datos de la habituación a corto plazo. Una típica media a corto plazo la curva de la habituación de los 20 ratones se muestra. Amplitudes de sobresalto de cada ratón en respuesta a 30 estímulos de sobresalto se normalizaron a la media de sus dos primeras respuestas de sobresalto en las pruebas 1 y 2. Los datos normalizados se promediaron luego a través de los ratones y el error estándar se calculó. Figura 7 Ejemplo de datos del IPP A:.. Promedio de los datos de PPI de 8 ratones se muestra. Los 10 ensayos de sobresalto solo del bloque II se promediaron para cada ratón y los promedios de los tipos de otro ensayo expresa como el porcentaje de los estímulos sólo amplitudes de sobresalto. La figura muestra la amplitud de la respuesta de sobresalto bajo diferentes condiciones de prepulso. Dos diferentes ISI (30 y 100 ms) y dos diferentes intensidades prepulso (75 y 85 dB) se midieron. B: los mismos datos que en A, pero representan en cantidad de PPI de sobresalto por ciento de la línea de base. Los datos mostrados anteriormente se restará de 100. Estos ratones mostraron un IBP máximo de alrededor del 50%. Tenga en cuenta que el mismo protocolo PPI rendimiento en la mayoría de las cepas de ratas de alrededor del 90%. Figura 8 Ejemplo de datos de la habituación a largo plazo A:.. Promedio de los datos LTH de 18 ratones se muestra. Tpor primera vez dos respuestas de sobresalto en el bloque I de cada día se promediaron en todos los ratones. Las barras de error estándar relativamente grandes son causados ​​principalmente por las diferencias en la amplitud absoluta de sobresalto entre los ratones individuales. B: Normalizado amplitudes sobresalto de 18 ratones durante cinco días. Con el fin de reducir el ruido, los grupos de 6 respuestas consecutivas de sobresalto en el bloque I (30 estímulos) fueron en promedio siempre por animal, resultando en cinco valores para el bloque I para cada animal por día. Estos fueron normalizados para cada animal en el primer valor del primer día (100%). La media de los 18 animales en la pantalla. Muestra STH dentro de cada día, así como LTH en cinco días.