Habituação e Prepulse Inibição de sobressalto acústico em Roedores

1. Protocolo de Design Calibração: Antes de um conjunto de experimentos, calibrar os alto-falantes. Isso é importante para mostrar que alto-falante o volume exato que foi definido pelo experimentador. Também calibrar a sensibilidade do transdutor plataforma das caixas de sobressalto acordo com o manual do fornecedor. O transdutor converte o movimento vertical da plataforma em um sinal de tensão. Certifique-se que não há experiências em curso, quando calibrar o sistema, e que todas as caixas são calibrados da mesma forma. função I / O: Se novas linhagens de camundongos ou ratos são medidos, uma função de entrada / saída deve ser estabelecida. Após um período de aclimatação de 5-10 minutos com um ruído de fundo constante brancos de 65 a 68 dB (veja abaixo), os estímulos de sobressalto (20 ms ruído branco) deve ser exibida a cada 20 segundos, começando em cerca de 70-75 dB. Sobressalto intensidade do estímulo será aumentado entre cada estímulo de 2-5 dB até atingir 120-130 dB, resultando em 10-30 ensaios com estímulos de sobressalto (ver figura 1). Protocolo estrutura: Habituação e inibição prepulse pode ser medido dentro de um protocolo. O protocolo é dividido em um período de aclimatação, um bloco I (habituação), imediatamente seguido por um bloco II (PPI, figura 2). Antes de medir prepulse inibição, os animais devem passar sempre pela habituação sobressalto, de modo que atenuações sobressalto devido à habituação não interferem com as medições PPI. Período de aclimatação: Cada vez que um animal é testado, ele primeiro passa por uma fase de aclimatação, a fim de adaptar-se ao detentor de animais, caixa de sobressalto e ruído de fundo. Durante um período de 5-10 minutos de aclimatação, o ruído de fundo constante de 65-68dB de ruído branco (dependendo do ruído do ambiente) é exibida, mas nenhum estímulo susto. Durante esta fase o animal se acalmar, parar de explorar o ambiente e parar de se mover. Bloco I habituação: Para curto prazo habituação (STH), entre 30 -100 estímulos startle deve ser aplicado no fundo. Estímulos sobressalto são ruídos comumente branco de 20 ms de duração e tempos de subida muito íngreme (0, se possível). A intensidade é idealmente no volume em que a função de i / o atingiu o platô de resposta de sobressalto máxima, geralmente em 105-115 dB. Os intervalos entre testes individuais devem ser sempre de 20 segundos ou aleatório entre 10 e 30 segundos (veja a discussão e figura 3). Bloco II prepulse inibição: Para medir PPI, os ensaios com um pulso de sobressalto sozinho e ensaios com um prepulse são pseudorandomized no bloco II. Ruído de fundo e de estímulo startle são os mesmos que no bloco I. O prepulse é um ruído branco de 4 ms de duração e também tempo de subida íngreme. Dois parâmetros podem ser variados: o intervalo entre interstimulus prepulse e surpreender pulso e da intensidade da prepulse (ver discussão). Propomo-nos geralmente usam dois diferentes intensidades prepulse (75 e 85 dB) e dois intervalos diferentes interstimulus (30 ms e 100 ms). Assim, existem quatro diferentes prepulse pulso-julgamentos mais o pulso de sobressalto sozinho ensaios a serem pseudorandomized e exibidos 10 vezes cada, totalizando 50 ensaios. Inter-julgamento intervalos podem ser 20 segundos ou aleatório entre 10 e 30 segundos (ver discussão). Em alguns casos, pode ser benéfico para adicionar um sexto tipo de ensaios, que é um julgamento prepulse sozinho (veja a discussão e figura 4). Habituação a longo prazo: A fim de medir LTH, todo o protocolo é executado em pelo menos cinco dias subseqüentes. Em alternativa, apenas a fase de aclimatação e bloco eu poderia ser executado, no entanto, a fim de ver LTH, bloco I deverá conter, pelo menos, de sobressalto 100 estímulos. A apresentação de 30 estímulos por dia leva a LTH muito pouco ou nenhum na maioria dos animais, especialmente em camundongos. Deve ser executado em aproximadamente o mesmo tempo de cada dia, uma vez que amplitudes resposta de sobressalto flutuar com o ciclo diurno. 2. Manuseio e Aclimatação de Animais Existem grandes diferenças no manejo e aclimatação de ratos contra ratos. Camundongos será colocado no suporte animal apropriado (não devem ser restringidos) por 2-5 minutos, com o ruído de fundo, mas sem assustar estímulos (fase de aclimatação do programa). Este procedimento deve ser repetido 3-5 vezes, uma ou duas vezes por dia, até fezes e urina no rato deixa o titular ou diminui consideravelmente. Detentores de animais devem ser sempre substituídos ou limpos depois que o animal é removido. Ratos devem ser manuseados por pelo menos três sessões de 17. No final das sessões de manipulação de terceiro que são colocados em um suporte apropriado animais (sem restringir a) e expostos ao ruído de fundo por vários minutos. Depois de removê-los, eles podem ser recompensados ​​com sementes de girassol a fim de formar passociações ositive com o procedimento de teste. Este procedimento é repetido mais duas vezes, gradualmente expandindo o tempo de aclimatação, antes de todo o protocolo é executado. Para os testes de sessões, os animais são colocados em todas as câmaras, portas fechadas eo protocolo com a fase de aclimatação, bloco I e II bloco é executado. Se existem diferentes grupos de animais (injeções, genótipos), que deve ser misturado ou randomizado sobre a corridas diferentes e as caixas diferentes. Se um animal é repetidamente testado (por exemplo, com diferentes tratamentos), ele deve ser re-testados na mesma caixa. Para repetir testes de PPI em ratos, também recomendamos para executar um protocolo completo antes da coleta de dados real ocorre. PPI geralmente melhora entre o primeiro eo segundo teste a sessão (PPI learning), e permanece consistente a partir daí. Ele também irá eliminar uma grande parte da LTH. 3. Análise de Dados Curto prazo habituação: Para análise a curto prazo habituação, todas as respostas de sobressalto do bloco I são plotados para cada animal. Se os animais dentro de um grupo têm similares amplitudes resposta de sobressalto, os valores podem ser em média entre os animais. Na maioria dos casos, no entanto, amplitudes absolutas startle diferem consideravelmente entre os animais e os níveis de sobressalto não são normalmente distribuídos. Neste caso é mais viável para normalizar os dados de cada animal para a sua primeira, ou a média dos dois primeiros, as respostas de sobressalto no bloco I (animais, por vezes, cair no sono durante a fase de aclimatação, resultando em uma resposta de sobressalto baixo primeiro e um alto startle segundo). Os dados podem então ser normalizada média de todos os animais, a fim de traçar o curso de habituação. Para uma avaliação quantitativa da quantidade de habituação, a pontuação pode ser calculado para cada animal, por exemplo, a média dos últimos 10 respostas startle dividido pela média das duas primeiras respostas (figura 6). Prepulse inibição: Para analisar prepulse inibição, os dados do bloco II tem que ser classificados de acordo com o tipo de ensaio (por exemplo, exportar todas as colunas de dados relevantes em excel e classificar por prepulse intensidade e duração do ISI). Os dez traços por tipo de teste são, então, em média, e os valores resultantes para os ensaios prepulse pulso são divididos pelo pulso de sobressalto só valor e multiplicado por 100. Isso revela a quantidade de sobressalto restantes (em percentagem da linha de base sobressalto) sob diferentes condições prepulse para cada animal. Linha de base de sobressalto (pulso sozinho) é 100%. Estes valores podem ser então na média entre os animais de um grupo e ser plotados (figura 7a). Alternativamente, a quantidade de PPI podem ser plotados subtraindo a resposta de sobressalto restantes de 100% (Figura 7b). Por favor, esteja ciente: quando você compara PPI em diferentes grupos de animais, você deve sempre também relatam a existência de uma diferença na base de sobressalto amplitudes, por exemplo comparando as amplitudes de sobressalto absoluta dos ensaios de sobressalto pulso sozinho (ou amplitudes de sobressalto no bloco I) . Habituação a longo prazo: A fim de analisar LTH as duas primeiras respostas do bloco I de cada dia são em média e plotadas sobre o mínimo de cinco sessões de testes consecutivos. Isso elimina a possibilidade de que diferenças no STH afetar o resultado da análise LTH. Se tiver sido estabelecido que um gene tratamento / não afeta STH, alternativamente todas as respostas em bloco I pode ser simplesmente uma média para cada dia e ser plotados. LTH pode ser quantificada pelo cálculo do escore de habituação, onde os últimos dias "valor é dividido por os primeiros dias" valor e multiplicado por 100, para que o percentual de nível de sobressalto inicial remanescente após LTH é exibida. Pontuações habituação pode ser média entre animais (figura 8). 4. Resultados representativos: i / o da função: Roedores normalmente começam a assustar a partir de um volume de 85-90 dB em (com 20 ms de duração, o ruído branco). A resposta de sobressalto aumenta com o volume cada vez maior e, normalmente, atinge um máximo de 100-110 dB. Se os animais se desviam consideravelmente a partir desses valores, os animais podem ter perturbado as habilidades de audição ou habilidades motoras. Típico i / o funções são exibidas na figura 5. Curto prazo habituação: ratos tratados Bem normalmente acostumar a cerca de 60% ​​de sua resposta de sobressalto inicial, no entanto, existem enormes diferenças individuais e também as diferenças de tensão. O efeito mais forte habituação ocorre normalmente na primeira estímulos diversos. Ratos têm geralmente menos de habituar ratos (normalmente a cerca de 80%), mas as diferenças tensão podem ser muito grandes. Um curso de habituação típico é mostrado na figura 6. Prepulse inibição: A maioria dos ratos mostram PPI de cerca de 90%, com uma ótima prepulse (85dB 4 ms, o ruído branco). PPI é muito robusto e as diferenças individuais são relativamente pequenos, com essas configurações experimentais. Menor volume de prepulsesrendem menos PPI e maior variabilidade (mesmo dentro de um animal), mas também parece ser mais vulnerável a manipulações farmacológicas ou genéticas. Resultados diferentes PPI são plotados na figura 7. Habituação a longo prazo: a habituação a longo prazo pode ser observada ao longo de várias sessões de testes. LTH é muito robusto em ratos. Em camundongos, que muitas vezes exige a apresentação de uma série de estímulos de sobressalto em cada sessão, a fim de observar LTH. Típico resultados LTH pode ser visto na figura 8. Figura 1. Protocolo de estímulo para a função de i / o. Depois de um período de aclimatação de 10/05 min. com 65 dB nível de pressão sonora (SPL) o ruído de fundo e não há estímulos de sobressalto (não mostrado), 20 ms estímulos ruído branco são apresentados a cada 20 segundos. A intensidade aumenta gradualmente de 75-130 dB em incrementos de 5 dB (bg = ruído de fundo). Figura 2. Estrutura Protocolo de habituação combinado e medição PPI. Durante todo o protocolo, um ruído de fundo constante de 65 dB é aplicada. Há um período de aclimatação de 10/05 min. sem qualquer estímulo adicional. Imediatamente depois, a habituação é testada por 3-10 estímulos startle (bloco I, ver figura 3). Este é imediatamente seguido por testes PPI (bloco II, ver figura 4). Figura 3. Protocolo de estímulo para medir a habituação (bloco I). Um exemplo de um bloco típico I para o teste de curto prazo habituação é mostrado. É composto de 30 100 testes idênticos, onde a 20 ms 105 dB de ruído branco, com um tempo de subida 0 é apresentado com um intervalo inter-ensaio (ITI), de 20 seg. Variações deste protocolo pode incluir intensidades mais elevadas de sobressalto estímulo ou variável ITIS Figura 4. Protocolo de estímulo para medir PPI (bloco II). Um exemplo de uma parte típica de um bloco II para testes PPI é mostrado. Bloco II consiste de 5-6 tipos diferentes julgamento que são apresentados 10 vezes cada em uma ordem pseudorandomized. Aqui, duas diferentes intensidades prepulse (75 dB e 85 dB) e dois intervalos diferentes interstimulus (Isis, 30 e 100 ms) são testados. Sobressalto estímulo sozinho ensaios e prepulse sozinho ensaios são intercalados. Este bloco teria 6×10 = 60 ensaios. Prepulses são 4 ms pulsos de ruído branco com 0 tempo de subida. Variações deste protocolo consistiria em ITIS variável, maior intensidade de estímulo de sobressalto, diferentes intensidades prepulse e / ou duração, e Isis diferentes entre prepulse e pulso. Figura 5. Exemplo de uma função de i / o. As curvas de entrada / saída de 11 ratos individuais da mesma estirpe são exibidos em cinza. Neste caso, as amplitudes de sobressalto individuais variam consideravelmente (respostas de sobressalto estão em unidades arbitrárias). A linha preta sólida mostra a amplitude média de sobressalto e erros-padrão em diferentes intensidades de estímulos susto. Estes ratos atingiram o seu máximo de resposta de sobressalto em torno de 105 dB. Figura 6. Exemplo de dados de curto prazo habituação. A curva de habituação médio típico de curto prazo de 20 ratos é mostrada. Amplitudes de cada sobressalto do mouse em resposta a estímulos startle 30 foram normalizados para a média de suas duas primeiras respostas de sobressalto em ensaios 1 e 2. À normalização dos dados foi, então, na média entre os ratos eo erro padrão foi calculado. Figura 7 Exemplo de dados PPI A:.. Dados médios PPI, de 8 de ratos é mostrada. Os 10 ensaios de sobressalto só do bloco II foram calculados para cada rato e as médias dos tipos de outro ensaio expresso em percentagem do estímulo sozinho amplitudes susto. A figura mostra a resposta de sobressalto amplitudes sob diferentes condições prepulse. ISIS dois diferentes (30 e 100 ms) e duas intensidades diferentes prepulse (75 e 85 dB) foram medidos. B: O mesmo que os dados em A, mas plotados como quantidade de PPI em percentagem do susto inicial. Os dados apresentados acima foi subtraído de 100. Esses camundongos mostraram um PPI máximo de cerca de 50%. Por favor note que o mesmo protocolo PPI rendimento da maioria das cepas de ratos de cerca de 90%. Figura 8 Exemplo de dados a longo prazo habituação A:.. Averaged dados LTH por 18 ratos é mostrada. Tele duas primeiras respostas de sobressalto no bloco I de cada dia, foram média de todos os ratos. A relativamente grande barras de erro padrão são causadas principalmente pelas diferenças de amplitude startle absoluta entre ratos individual. B: amplitudes Normalized de sobressalto, de 18 mouses mais de cinco dias. , A fim de reduzir o ruído, os grupos de 6 consecutivas respostas de sobressalto no bloco I (30 estímulos) sempre foram em média por animal, resultando em cinco valores para o bloco I, para cada animal por dia. Estes foram normalizados para cada animal para o primeiro valor do primeiro dia (100%). A média de todos os 18 animais é exibida. Ele mostra STH dentro de cada dia, bem como LTH em cinco dias.