Eine einfache Methode zur Bildgebung Arabidopsis Leaves Mit Perfluordecalin als Infiltrative Imaging Medium
Summary
Wir beschreiben die Verwendung von Perfluordecalin als infiltrative Eindeckmedium. Dies ist eine einfache Methode zur Verbesserung der Tiefe der Bildgebung in<em> Arabidopsis thaliana</em> Blattgewebe mit minimalen physiologischen Auswirkungen.
Abstract
Das Problem des Erwerbs von hochauflösenden Bildern tief in biologischen Proben wird allgemein 1 quittiert. In luftgefüllte Gewebe wie die schwammige Mesophyll der Blätter der Pflanze oder Wirbeltier-Lungen weitere Schwierigkeiten ergeben sich aus mehrere Übergänge im Brechungsindex zwischen zellulären Komponenten, zwischen Zellen und Lufträume und zwischen dem biologischen Gewebe und der Rest des optischen Systems. Darüber hinaus führen Brechungsindex Missverhältnis zur Dämpfung von Fluorophor Anregungs-und Emissions-Signal in der Fluoreszenzmikroskopie. Wir beschreiben hier die Anwendung der Perfluorcarbon, Perfluordecalin (PFD), als infiltrative Imaging Medium, das optisch verbessert konfokaler (LSCM) Probenabbildung in der Tiefe, ohne auf schädliche Anstieg der Laserleistung und hat nur minimale physiologische Wirkung 2. Wir beschreiben das Protokoll für den Einsatz von PFD mit Arabidopsis thaliana Blattgewebe, die optisch komplexer als Ergebnis seiner istStruktur (Abbildung 1). PFD hat eine Reihe von Attributen, die es für diese Verwendung geeignet 3 machen. Der Brechungsindex von PFD (1.313) ist vergleichbar mit der des Wassers (1,333) und ist näher an der Cytosol (ca. 1,4) als Luft (1,000). Darüber hinaus ist PFD leicht verfügbar, nicht-fluoreszierenden und ist ungiftig. Die geringe Oberflächenspannung des PFD (19 Dyn cm -1) ist niedriger als die von Wasser (72 Dyn cm -1) und auch unter dem Grenzwert (25 bis 30 Dyn cm -1) für Stomata Eindringen 4, die es zu Überschwemmungen erlaubt das schwammige Mesophyll Lufträumen, ohne die Anwendung eines potenziell destruktiven Vakuum oder Tensid. Schließlich und vor allem hat PFD eine große Kapazität zur Auflösung von CO 2 und O 2, die den Gasaustausch in den überfluteten Gewebe aufrechterhalten werden, damit die Minimierung der physiologischen Wirkung auf die Probe ermöglicht. Diese Eigenschaften wurden in verschiedenen Anwendungen, die teilweise flüssige Atmung und Lunge Inflation sind benutzt wordenTION 5,6, Chirurgie 7, künstlichem Blut 8, Sauerstoffversorgung des Wachstums Media 9, sowie Studien über die Bildung von Eiskristallen in Pflanzen 10. Derzeit ist es üblich, Gewebe in Wasser oder wässrigem Puffer für Live-konfokale Abbildung montieren. Wir denken, dass die Verwendung von als Eindeckmedium PFD eine Verbesserung gegenüber der bisherigen Praxis dar und ermöglicht die einfache Herstellung von Live ganzen Blattproben für die Bildgebung.
Protocol
Discussion
Dies ist eine einfache und leicht zu bedienen Technik Mikroskopie von luftgefüllten oder optisch komplexen Geweben zu verbessern. Wir haben gezeigt, dass die Technik einige starke Vorteile hat und wir hoffen, dass es verwendet wird, um biologische Fragen zu Luft-reichen Geweben aufzuklären. Zum Beispiel wäre es eine natürliche Wahl für die Untersuchung der Erreger Angriff in Anlage Mesophyll oder in der Lunge sein. Wir sind uns der Grenzen der Technik. Wir sind auf eine bessere Brechungsindexanpassung arbeiten, mit anderen Formen der Mikroskopie und Perfluorcarbon Deckfluessigkeit Nachschub während der langen Zeitskala Experimente verwenden. Wir erkennen auch an, aber, dass einer der Hauptvorteile von FKW, nämlich als biologisch inert hat eine Kehrseite. PFCs nicht gut lösen biologische Moleküle, die auch bedeutet, dass sie nicht einfach verwendet werden, um Verbindungen von Interesse wie Hormone, Medikamente und andere kleine Moleküle oder Ionen zu liefern.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren bedanken sich bei Prof. Nicholas Smirnoff von der University of Exeter für seine Beratung und der University of Exeter Bioimaging Einrichtung bedanken. Die Finanzierung wurde von der britischen Biotechnology and Biological Sciences Research Council (Stipendium Referenz BB/E002682/1) zur Verfügung gestellt.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Perfluorodecalin | F2 Chemicals | N/A | Telephone to order. |
| Carolina Observation Gel | Blades Biological | 13-2700 |
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