Un metodo semplice per l'imaging Arabidopsis Foglie Utilizzando Perfluorodecalin come Media Imaging infiltrativa

Il protocollo indicati di seguito descrive un metodo semplice per l'utilizzo di PFD come mezzo infiltrativa di montaggio in foglie di Arabidopsis thaliana, ma possiamo anticipare che questo metodo può essere utilizzato in una varietà di applicazioni di imaging in cui si desidera l'aria ricca di tessuti. 1. Campioni di foglie di montaggio in PFD Preparare un vetrino da microscopio con un gas-permeabili guarnizione di polidimetilsilossano (PDMS, Carolina Gel di osservazione). PDMS è un polimero viscoelastico e può essere modellata per fornire una camera di misura per esigenze sperimentali. Equilibrare PFD con l'aria. Ciò può essere ottenuto facendo gorgogliare aria o agitando un piccolo volume di PFD in un aria piena di bottiglia. Decantare PFD in un piatto aperto Petri e galleggiare una piantina intera o foglia asportato il PFD per 5 minuti. Il tessuto deve diventare trasparente, che ricorda di tessuto vetrificato (Figura 2 (a)). Le foglie possono apparire più scura o più chiara rispetto a prima esposizione a PFD, dipendenzading in condizioni di illuminazione e l'età dei tessuti utilizzati. Riempire la camera di PDMS di aria equilibrato PFD e con attenzione trasferire i campioni di tessuto dal piatto di incubazione Petri alla camera di PDMS. Sigillare il vetrino con un coprioggetto e l'immagine a seconda delle esigenze sperimentali. Nota: PFD funzioni anche bene in una camera aperta costruita su un vetrino o in una camera di perfusione ed è compatibile con grasso al silicone. PFD non è compatibile con i componenti in Teflon, come li dissolve. 2. Rappresentante dei risultati: Ispezione al microscopio di PFD-incubate campioni di foglie dimostra che la maggior parte di spazi aerei sono inondate. Figura 2 (b) mostra spazi aerei inondato di ricombinanti GFP sospeso in PFD. E 'evidente che la foglia è invaso su incubazione con PFD, ma che occasionalmente sacche d'aria può rimanere. L'acqua non inondare la foglia in queste condizioni. LSCM dei campioni incubati e montato in una ir, acqua o spettacoli PFD PFD che dà un vantaggio per l'acqua e l'aria nella profondità delle immagini possibili (Figura 3). L'esempio riportato in Figura 3 mostra Arabidopsis aria, acqua e PFD montato lascia esprimere cytosolically localizzato Venere, una variante di YFP 11 che si esprime costitutivamente sotto il promotore 35S. Possiamo vedere di circa 2 volte maggiore profondità delle immagini quando si confrontano PFD e acqua. Va notato, tuttavia, che il miglioramento preciso visto quando si usa PFD varia con apertura numerica della lente e il tipo di tessuto utilizzato. Abbiamo visto in streaming citoplasmatici e capelli allungamento radice in PFD piantine trattate, ognuno indicativo di piante sane. Inoltre abbiamo dimostrato che 2 Fv / Fm, una misura del funzionamento di fotosintesi delle piante 12 rimane entro limiti tollerabili su scale temporali utilizzati nella diagnostica per immagini. 3394fig1.jpg "/> Figura 1. Impianto di complessità e le implicazioni foglia ottica Diagrammatical rappresentazione che mostra le caratteristiche anatomiche della A. foglia thaliana in relazione al set-up ottico. Abbreviazioni usate sono obj. = Lente dell'obiettivo, imm. = Fluido immersione, cov. = Coprioggetti, mnt. = Montaggio, taglio. = Cuticola, annuncio. ep. = Epidermide adaxial, st. = Poro stomatica, sp. = Mesofillo spugnoso, come = spazio aereo, amico. = Palizzata mesofillo, vb = fascio vascolare, annuncio. ep. = Epidermide adaxial. Pareti cellulari sono indicati da linee nere. Figura 2. PFD penetra facilmente foglie di Arabidopsis (A) Foglie incubate in aria, acqua o PFD per 5 minuti e ripreso con una fotocamera digitale Leica DCF3000FX con un microscopio Leica MZ16F (Leica Microsystems (UK) Ltd., Milton-Keynes, UK). Il logo Giove era stampato su pellicola di acetato ed illuminato indietrom al di sotto con una scatola di luce. Tempo di esposizione è stato di 89 ms e tutte le immagini sono stati raccolti e trattati in modo identico. Barre di scala rappresentano 2 mm. (B) PFD portando ricombinante purificata proteina verde fluorescente (GFP), delimita spazi aerei in vivo. GFP è falso colore verde e rosso è usato per mostrare l'auto-fluorescenza della clorofilla, che delimita le cellule del mesofillo. (Figura 2 (b) riprodotto con il permesso e tutti i dettagli tecnici disponibili in Littlejohn et al. 2010 2). Barre di scala rappresentano il 25 m. Figura 3. PFD migliora l'imaging confocale in foglie Immagini che mostrano LSCM cytoplasmically localizzato Venere fluorescenza (verde) e autofluorescenza della clorofilla (rosso) in A. thaliana lascia intatto ripreso in aria, acqua o PFD. Lunghezza d'onda di eccitazione è 514 nm ed emissione di fluorescenza è stato registrato a 518 nm 604 nm per Venere e at 657 nm679 nm per cloroplasti. Ogni pannello è un'unica sezione confocale preso da una pila di Z-11 immagini acquisite confocale a intervalli di 5 micron. Questi sono stati estratti da un pieno Z-stack di 59 immagini acquisite ad intervalli di 1 micron, che sono stati usati per produrre film supplementari. Misure di profondità sono date relativamente alla superficie epidermica. Immagini rappresentative, che sono stati trattati in modo identico, vengono visualizzati. Dettagli sperimentali come le impostazioni microscopio sono identiche a quelle trovate in Littlejohn et al., 2010 2. Scalebars rappresentano il 20 micron.