Heterogeniteit in kaart brengen van de expressie van eiwitten in tumoren met behulp van kwantitatieve Immunofluorescentie

1. Tissue voorbereiding Microtomy Deel formaline gefixeerd paraffine ingebed tumor blokken op 4 micrometer dik met behulp van een roterende microtoom. Leg de delen op positief geladen microscopische dia's. Incubeer dia's in een 37 ° C oven gedurende de nacht. Opslagruimte Bewaar secties in een -18 ° C tot -25 ° C vriezer, om verlies van antigeniciteit te voorkomen. 2. Immunofluorescentie van weefselcoupes Ontdoen en rehydratatie Dewax dia's in xyleen twee keer gedurende 5 minuten. Hydrateren dia's in 99%, 99%, 80%, 50% van ethanol en stromend water gedurende 2 minuten van elke in orde is. Antigen Retrieval Voer de warmte geïnduceerde antigen herstel, met behulp van 0,15 mM natriumcitraat, pH 6,0 buffer in een snelkookpan gedurende 5 min in de microwave. Cool down dia's voor 20 minuten. Spoel de objectglaasjes in 0,05% PBST gedurende 5 minuten op de rocker. Het blokkeren van de procedure Behandel secties in 3% waterstofperoxide gedurende 10 minuten. Spoel de objectglaasjes in 0,05% PBST gedurende 5 minuten op de rocker. Voeg de secties om Sequenza Immunokleuring rack. Behandel secties in serum vrij eiwit te blokkeren gedurende 10 minuten. Primair antilichaam incubatie Incubeer primaire antilichaam verdund tot een optimale verdunning in Dako antilichamen verdunningsmiddel voor 1 uur bij kamertemperatuur. Spoel in 0,05% PBST drie keer voor 5 minuten per stuk. Epitheliale masker (Cytokeratine) incubatie Incubeer muis anti-pan cytokeratin, verdund in Dako 01:50 antilichaam verdunningsmiddel overnacht bij 4 ° C. Epitheliale masker visualisatie Bereid een 1:25 verdunning van de geit anti-muis Alexa555 secondary antilichaam in de pre-verdunde Envision geit-konijn antilichaam HRP-oplossing. Incubeer dia's in het donker voor 1,5 uur bij kamertemperatuur. Spoel in 0,05% PBST drie keer voor 5min per stuk. Target visualisatie Overdracht van de dia's uit de Sequenza om de vochtigheid kamer. Combineer Target signaalversterking oplosmiddel (HistoRx bad E) en de Cy5 tyramide (HistoRx buis F) op 1:50 concentratie. Vortex om goed te mengen. Incubeer dia's in het donker gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Spoel in 0,05% PBST drie keer voor 5 minuten per stuk. Uitdrogen dia's in 80% ethanol gedurende 1 minuut. Lucht drogen dia's in het donker. Tegenkleuring en afdekken Van toepassing DAPI montage medium op de dekglaasjes en plaats de dekglaasjes over het weefsel secties. Droge dia's 's nachts in het donker. Na de dia's zijn opgedroogd, veilig met nagellak aan enervoor dat het langdurig bewaren en te houden in een 4 ° C koelkast. 3. Beeld vast te leggen met behulp van hele sectie scanning Laad maximaal vijf dia's in de schuif cassette van de Aperio ScanScope FL diascanner. Voor elke dia, selecteert u de algemene regio om de afbeelding met behulp van de interface in het ScanScope Console. Selecteer de regio om alle weefsels omvatten op de dia, ongeacht kleuringspatroon of andere waarneembare aspecten van het monster. Met behulp van de ScanScope Console, voor elk kanaal (DAPI, Cy3 en Cy5) te bepalen een optimale belichting als volgt: Selecteer een regio van weefsel te ondervragen – dit gebied moeten, idealiter in de tumor gebied van weefsel om de beste weergave te bieden. Met behulp van de automatische belichting ScanScope Console-functie, evalueren van de belichtingstijd voorgesteld voor elk kanaal, samen met beeld scherp te stellen. Herhaal dan tot 3-5 regio's van elk monster om samen tenfirm de stabiliteit van de waarde. Kies een extra regio (zoals aangetoond door een blauwe diamant op de ScanScope console afbeelding) uit de buurt van het weefsel, maar nog steeds binnen de dekglaasje regio van de glijbaan, op een achtergrond waar vlakke veld correctie beelden zullen worden verworven voor elk filter te definiëren. Herziening van deze foto's voorafgaand aan de beeldopname. Als de beelden lijken te hoge achtergrond of andere afbeelding artefacten hebben, moet het beeld regio worden verplaatst en nieuwe beelden verworven. De verworven digitale dia's worden automatisch geupload naar de Aperio Spectrum database. 4. AQUA automatische beeldanalyse Bekijk de digitale hele dia's in de Spectrum-database en annoteren tumor gebieden van belang in de context van het hele weefsel en kleuringspatroon (s). Selecteer de dia met behulp van AQUAnalysis van de digitale lijst met dia's in de Spectrum-database te analyseren door te dubbelklikken op de duimspijker beeld (als alternatief, schakelt u het selectievakje naast de afbeelding en selecteer vervolgens in het menu aan de bovenkant van de lijst 'Images View'). Dit opent automatisch de ImageScope software en de kleur samengevoegde afbeelding van het weefselmonster. Deze software gebruiken om het beeld met behulp van het bijgeleverde gereedschap navigeren. Met behulp van de bijbehorende H & E (ofwel de fysieke dia of een geannoteerde afbeelding), aantekeningen het gebied van de rente op de fluorescerende beeld. Meerdere regio's van belang, de individuele omcirkelde gebieden, kunnen worden geselecteerd op een enkel monster. Er is ook een 'negatieve' tool die wordt gebruikt om gebieden binnen een geselecteerde regio (dat wil zeggen beschadigd weefsel, gebieden met een slechte histologie, niet-tumor gebieden, puin, etc.) uit te sluiten. Sla de annotatielaag (s) op de afbeelding. Terug naar het Spectrum hoofdmenu en schakelt u het selectievakje naast het beeld dat was gewoon geannoteerd. Selecteer 'Analyseer' uit het menu strip aan de bovenkant van de lijst. In de Analysis venster, die zullen komen, select "HistoRx AQUA Analysis" uit het pull-down menu. Als er meerdere lagen van annotaties, gebruik de selectievakjes om de juiste laag (s) voor analyse te selecteren. Druk op de 'Analyze' knop als je klaar bent om te beginnen. Op dit punt, zal een console geminimaliseerd venster in de taakbalk van Windows. Dit toont de voortgang van de overdracht van beelden van de Spectrum database naar de lokale PC (de 'pull' werking). Zodra de data wordt overgedragen, zal AQUAnalysis lanceren. De gebruiker kan vervolgens gebruik maken van alle van de interne functies van de software te bekijken, navigeren en analyseren van beelden. De geannoteerde regio van het beeld van de Spectrum-database is opgedeeld in 512×512 pixel afbeelding tegels – die elk zal afzonderlijk worden gescoord. Voor deze studie werd een onbewaakt AQUA scoring algoritme, gebaseerd op gegevens clustering, gebruikt 8. In dit algoritme, zijn AQUA scores als volgt gegenereerd: De pan-cytokeratine image signal is thresholded boven de achtergrond en die pixels worden gebruikt om een ​​tumor 'masker', die vervolgens wordt gebruikt voor de volgende berekeningen te definiëren. De high-expressie pan-cytokeratin pixels worden ook de cytoplasmatische / niet-nucleaire regio's van de tumorcellen. Pixels met een hoge signaal in de DAPI kanaal dat zich binnen de tumor masker worden geïdentificeerd als kernenergie in de natuur. De clustering algoritme onderzoekt ook pixels die lage intensiteit voor zowel DAPI vlekken of cytokeratine expressie en pogingen om gedeeltelijk ze toe te schrijven aan de nucleaire of cytoplasmatische compartimenten, of achtergrond hebben ofwel. Als alle pixels worden toegewezen aan een van de tumor compartimenten of achtergrond, de intensiteit van het signaal van het doelwit proteïne (ER of HER2) wordt vervolgens berekend binnen elk van de compartimenten en genormaliseerd naar de grootte van de compartimenten, waardoor de productie van AQUA scores. Afbeeldingen die niet over voldoende tumor vertegenwoordiging werden niet gescoord (zoals gedefinieerd door mensen met less dan 5% van de pixels die tumor). Deze regio's produceren ook een 'Eindresultaat' waarde genaamd 'Fail' en kan dus verwijderd worden in de daaropvolgende statistische analyses. Bovendien, als na toetsing, een exploitant velden, die niet geschikt waren voor het scoren te wijten aan sample of imaging artefacten (bijv. gevouwen weefsel, puin) geïdentificeerd, werden deze velden geredigeerd te scoren en produceerde een 'Final Result', genaamd 'Fail'. De resultaten van AQUA scoren zijn tabellen van de scores die bij elke 512×512 pixel tegel in de regio van belang in een hele weefselsectie steekproef. Deze bestanden, in. CSV-formaat, kan vervolgens worden gebruikt voor verdere statistische analyse. 5. Statistische analyse: Alle statistische analyses zijn uitgevoerd in SPSS (IBM) Waar mogelijk, voor grote operaties, het genereren van SPSS syntax-code-bestanden (. SPS) om gegevens manipulaties en analyses stappen uit te voeren. Voorbeeld syntax code wordt verstrekt als aanvullende bestanden. <li> Lees databestanden in SPSS. Verwijder ongebruikte variabelen in de ruwe data (bijv. instrument specifieke parameters, AQUA scores van de niet-gebruikte compartimenten). Waar de regio's een 'Eindresultaat' van 'Fail' (zie hierboven) hebben, markeren deze waarden als SYSMIS, die hen verwijdert van de numerieke analyses. Geaggregeerde alle gegevens voor alle dia's voor elke marker (ER of HER2) in een enkele stamgegevens in SPSS formaat. Gebruik deze master file voor alle volgende berekeningen. Met behulp van een SPSS syntax-bestand (een voor elke marker: ER of HER2 (zie aanvullende syntax-bestanden) gegevens werd verder gevalideerd en Simpson indices van diversiteit als volgt berekend: Het genereren van een meester analytisch bestand, om wijziging van de master data set eerder gegenereerd te voorkomen. Validatie van de master data afgezet tegen de ruwe data en beelden gegenereerd. Produceren overzichtsstatistieken voor AQUA scores voor elk monster (graaf van velden, gemiddelde score, de mediaan score, mogelijk b.m score, maximale score, en de standaarddeviatie van de scores voor monster). Check een willekeurige steekproef van de resultaten ten opzichte van de oorspronkelijke ruwe data output-bestanden en tegen de RAW-beeldgegevens gescoord. Om de warmte kaartbeelden (getoond in de figuren 2 en 3) te genereren: 'Bin' van de AQUA score gegevens (met behulp van de "Visual binning 'functie in SPSS) in acht verschillende niveaus. Voor de ER, werden nucleaire scores gebruikt voor HER2, cytoplasmatische scores werden gebruikt. Ontlenen bakken zodanig dat elke bak een gelijk percentage van de beschikbare cases uit de gehele dataset representeert. Gebruik maken van de SPSS functie 'Split File', zodat alle volgende uitvoer zou worden op het niveau van een 'per dia / monster ". Plot elke regio (wat overeenkomt met een 512×512 tegel) door de x, y-coördinaten en kleur met een waarde die overeenkomt met de bin in waarvan zij is toegekend (zie figuren 2 en 3). Voor het genereren van heterogeniteit scores, werd code geschreven om een ​​Simpson's genererenindex van de diversiteit met behulp van AQUA scores. De Simpson index van diversiteit, zoals hier gebruikt, wordt gedefinieerd als: Waarbij N het totaal aantal scores / velden worden gebruikt voor een gegeven monster en n het aantal scores / velden in een bepaalde groep van gestandaardiseerde scores (geproduceerd zoals hieronder beschreven). Gebruik de master-analytische bestand hierboven beschreven voor de gegevensbron. In de getoonde voorbeelden zijn alle ER berekeningen die de nucleaire AQUA score en HER2 berekeningen die de cytoplasmatische AQUA score. Voer de onderstaande berekeningen voor elk monster / dia. Omdat fluorescentie van gegevens is onderworpen aan de variantie instabiliteit, zodanig dat fout omvang uitdraagt ​​met intensiteit, toe te passen logaritmische (base 2) normalisatie aan alle AQUA scores. Verder is de genormaliseerde (log-getransformeerde) gegevens om te zetten in z-(standaard) scores. De Z-score transformatie is berekend op eens volgt: Z = (AQUA score – gemiddelde van alle scores voor een sample) / standaarddeviatie van de scores voor het monster. Dit vertaalt zich de verdeling van de scores in een verdeling van de afwijkingen rond de centrale waarde van nul afwijking. Bin deze Z-score waarden in zes groepen (<-2, -2 – -1, -1 – 0, 0-1, 1 – 2,> 2). Bereken het aantal waarden toegekend in elke bak en bedrag voor elke bak. Gebruik deze waarde, samen met het totaal aantal velden, een waarde voor elk van de zes bakken worden gebruikt voor de index te berekenen. Som van deze waarden en aftrekken van de ene naar de index van diversiteit te produceren. De diversiteit index geeft een indicatie van de spreiding van scores rond het gemiddelde voor een bepaald monster. Dus, hogere indices wijzen op een bredere spreiding van de scores, of toegenomen heterogeniteit van meningsuiting. Omgekeerd, lagere indices, geven minder variatie in de expressie meten en homogene expressie in het monster. Dit wordt geïllustreerd in Figures 2 en 3. 6. Representatieve resultaten: Gerichte therapie met een relatief lage toxiciteit stoffen, zoals tamoxifen en trastuzumab, zijn niet standaard van zorg voor patiënten met ovariumcarcinoom. Er zijn duidelijke aanwijzingen dat de platina-taxaan eerstelijns chemotherapie is superieur aan andere chemotherapie voor eierstokkanker 9-13, en terwijl 70-80% van de patiënten in eerste instantie te reageren, de meesten zullen terugval en sterven van hun ziekte. Meting van biomarkers, die naar aanleiding van alternatieve therapieën kunnen voorspellen zou nuttig zijn bij het selecteren van geïndividualiseerde therapie voor elke patiënt, en aangezien chemotherapie oefent druk uit op een selectie tumor, overlevende tumorcellen kunnen bezitten verschillende karakteristieken en vertegenwoordigen een subpopulatie van de tumor voor de therapie; kwantificering van deze verandering zou dus nuttig zijn. We pasten onze heterogeniteit in kaart brengen van aanpak van de ER en HER2 expressie in eierstokkanker exemplaren voor en na de chemotherapie, in de Order om kwantitatieve veranderingen in expressie te meten, en beoordelen van de relatie tussen de biomarker expressie voor en na de therapie. Zowel de ER en HER2 aan te tonen duidelijke heterogeniteit binnen de afzonderlijke tumoren, en in sommige tumoren, van de Simpson index verandert na de behandeling van relatief hoge heterogeniteit aan lage heterogeniteit, vertegenwoordigd door het verminderen van Simpson's index scores (zie figuren 2 en 3). Dit ondersteunt het idee dat klonale selectie ontstaat als reactie op cytotoxische chemotherapie, wat nog belangrijker is, dit kan worden misbruikt via gerichte therapie tegen de resterende bevolking, met het oog op een betere behandeling te personaliseren voor kankerpatiënten. Figuur 1. Hematoxyline en eosine gekleurde microfoto's van de verschillende gebieden van dezelfde eierstokkanker met variabele morfologie. (A) x40 microfoto toont twee aangrenzende gebieden van de tumor met verschillende morfologie. Hoog vermogen uitzicht (x200) onthullen cellen met cytoplasmatische clearing en een solide patroon van de groei in het bovenste deel van de tumor (B), terwijl het onderste deel van het weefsel (C) heeft meer homogene eosinofiele cytoplasma en een papillaire groeipatroon. Deze tumor zou echter, worden geclassificeerd als sereuze papillaire histologische subtype ten behoeve van verdere beheer. Figuur 2. Heterogeniteit heatmaps van ER expressie van eiwitten in cytokeratine-positieve kanker van de eierstokken weefsel, vóór (bovenste paneel) en na (onderste paneel) therapie. Figuur 3. Heterogeniteit heatmaps van HER2 expressie van eiwitten in cytokeratine-positieve kanker van de eierstokken weefsel, vóór (bovenste paneel) en na (onderste paneel) therapie.