La experimentación animal ha sido aprobado por la Oficina Cantonal de Veterinaria (Zurich, Suiza). La vivienda y los procedimientos experimentales fueron de acuerdo con la ley suiza de Protección Animal y se ajustan a la Directiva europea sobre la protección de los animales utilizados para fines científicos (Directiva 2010/63/EU DEL PARLAMENTO EUROPEO Y DEL CONSEJO de 22 de septiembre de 2010). 1. Pre-operatorio consideraciones 1.1 Los ratones: las necesidades de vivienda, estado general y vigilancia de la salud Se recomienda que los ratones entrega de los proveedores o transferidos de colonias de roedores externa debe llegar a las instalaciones de la vivienda al menos dos semanas antes de la cirugía. Este período debe permitir que los animales para adaptarse al nuevo entorno y las instalaciones específicas de las condiciones de vivienda. Los ratones, los animales que viven social, deben ser alojados en grupos compatibles durante este período de adaptación. Para la supervisión de una persona delos alimentos y el consumo de agua, cada ratón se encuentra separado de 3 días antes de la cirugía hasta 10 días después de la implantación quirúrgica del transmisor. La línea de tiempo para el establecimiento de telemetría de soporte transmisor-ratones se muestra en la Figura 1. Es crucial que los animales proceden de la cirugía de buena salud y condición. Por lo tanto, antes de la cirugía, los animales deben ser controlados una vez al día durante 2-3 días respecto a la condición general (apariencia, postura, comportamiento espontáneo), así como por el peso corporal, consumo de alimentos y agua. Estos datos están documentadas en un registro médico (estado general de salud y la hoja de control de datos, Tabla 1) para establecer los niveles individuales de referencia de la condición general y la salud general y bienestar. Todos los animales que presenten síntomas de enfermedad o deterioro de las condiciones generales antes de la cirugía debe ser excluido de la prueba. 1.2 Cabello recorte de un día antes de la cirugía El día antes de la implantación, con el fin de afeitar el animals de la cirugía, los ratones son anestesiados brevemente en un pequeño (8x8x8cm) cámara de plexiglás con sevoflurano (8%) o el isoflurano (5%) con oxígeno puro (600 ml / min). Después de la pérdida del reflejo de enderezamiento, el ratón se saca de la cámara anterior y el pelo del cuello y el abdomen se recorta con el animal tumbado en posición de yacer dorsal, la anestesia se mantiene durante aproximadamente 5 minutos con una máscara nasal con sevoflurano 3-4% o isoflurano 1,5-3% de oxígeno puro con un caudal de 600 ml / min. Después de cortar el pelo, los animales se les permite despertar y entonces se trajo de vuelta a su jaula. 2. Implantación 2.1 Entorno de funcionamiento, preparación del transmisor de telemetría En el día de la implantación, todos los procedimientos relativos a la preparación del transmisor y la cirugía se lleva a cabo en un banco de trabajo con una campana de flujo laminar equipada con un microscopio quirúrgico. Condiciones asépticas están asegurados por el uso de instrum autoclavelos padres y los materiales esterilizados y desinfectar el banco de trabajo 7. Antes de la implantación, los transmisores de telemetría (ETA-F10, Data Sciences International, St. Paul, MN, EE.UU.) se prepara en primer lugar. Después de quitar de su paquete estéril, los cables del transmisor se acortan a una longitud apropiada para el tamaño del ratón para ser implantados. En la mayoría de los ratones adultos en reproducción o líneas consanguíneas, el electrodo rojo se puede reducir a aproximadamente 42 mm y el electrodo blanco / incoloro a una longitud de aproximadamente 55 mm. Tubo de aislamiento se retira de la parte distal (sensorial) parte de los conductores: aproximadamente 20 mm de tubo se retira el electrodo de color rojo, de aproximadamente 10 mm de tubo se retira el electrodo blanco / incoloro. La parte distal de cada electrodo (que ahora es sin tubo) se forma en un bucle fijando el extremo con suturas de seda fina (PERMA-Handseide, 6-0, Ethicon, Norderstedt, Alemania). Después de la preparación de los electrodos, el transmisor se coloca en wade solución salina estéril rm listo para ser implantado cuando el animal está anestesiado y preparado quirúrgicamente. 2.2 Anestesia En 5-10 minutos antes de la inducción de la anestesia por inhalación, una mezcla de midazolam (4 mg / kg) y fentanilo (0,04 mg / kg) se administra por vía subcutánea como premedicación, proporcionando así la sedación y la analgesia preventiva. General de la anestesia por inhalación se induce mediante la colocación de los animales en la cámara de inducción y la introducción del agente anestésico volátil (sevoflurano 8% o 5% de isoflurano en oxígeno puro 600 ml / min). Cuando el animal muestra una pérdida del reflejo de enderezamiento se transfiere al banco de trabajo bajo la campana de flujo laminar, y se coloca en posición de yacer dorsal sobre una placa de metal especialmente diseñado, provisto de una máscara nasal y los tubos del aparato de anestesia. La anestesia se mantiene la respiración espontánea (3-4% de sevoflurano o isoflurano 1,5-3% de oxígeno puro a una velocidad de flujo de 600 ml / min). Durante la anestesia, el ojo del animals están protegidos con un ungüento (vitamina A, Baush & Lomb, Steinhausen, Suiza). Mientras está acostado en la placa de metal que el animal es calentado por la superficie del baño de agua caliente (39 ° C + / -1) de la mesa de trabajo. 2.3 Cirugía La piel de la región anterior del cuello y el abdomen se desinfecta con alcohol al 70%. A 1 – incisión de 1,5 cm de largo en la piel se hace desde el tórax inferior a lo largo de la línea media del abdomen. El negativo (blanco / incoloro) no está tunelizado subcutáneamente desde el tórax hasta el cuello, donde se hace una pequeña incisión (≤ 0,5 cm) en la dirección longitudinal. La piel y los tejidos están preparados para hacer espacio para la fijación del asa de alambre del electrodo. El lazo de alambre se fija entre los músculos situados a la derecha de la tráquea, con dos suturas de seda fina (PERMA-Handseide, 6-0, Ethicon, Norderstedt, Alemania). La herida en el cuello se cierra con suturas absorbibles (VICRYL 6-0, Ethicon, Norderstedt, Alemania), en capas. La pared abdominal se abrió en la línea alba y el cuerpo del transmisor de telemetría se coloca en la cavidad abdominal de los ratones. El lazo de alambre de lo positivo (rojo) se sutura a la apófisis xifoides con suturas de seda de tal manera que se sitúa entre el hígado y el diafragma en la región abdominal superior izquierda (Figura 2). Luego, las capas musculares de la región abdominal se cierra con suturas absorbibles (VICRYL 6-0, Ethicon, Norderstedt, Alemania). Antes de finalmente cerrar la pared abdominal, una mezcla de Sulfadoxin y Trimetoprim [(30 mg / kg y 6 mg / kg, respectivamente; disuelto en 1 ml de solución salina (0,9%) y en la temperatura corporal de aproximadamente (38 a 39 ° C)] se inyecta en la cavidad abdominal a los efectos de la profilaxis anti-infecciosos y para apoyar la homeostasis de fluidos. Finalmente, la piel de la región abdominal se restaura con grapas (precisión, 3 Cuidado de la Salud M, St. Paul, MN, EE.UU.). 3. Cuidados post-operatorios Tras la finalización de la cirugía y la anestesia, 0,1 mg / kg de buprenorfina (Temgesic, Essex Chemie AG, Lucerna, Suiza) y 5 mg / kg de meloxicam (Metacam, Boehringer Ingelheim, Basilea, Suiza) se administra por vía subcutánea para el tratamiento del dolor, y la los animales se dejan en el agua tibia (39 ° C + / -1) la superficie de la mesa de trabajo para recuperar aproximadamente 2 horas. Junto con el alivio del dolor (dos veces al día: la buprenorfina, 0,1 mg / kg y meloxicam 5 mg / kg), la terapia de apoyo consiste en 300 l de glucosa (5%) y 300 l de solución salina (0,9%) calentado a la temperatura corporal, se aplica por vía subcutánea dos veces al día durante 4 días. Para apoyar la recuperación de más, vale la pena ofrecer a los animales con una botella de bebida que contiene más del 15% de solución de glucosa. Durante el período de recuperación de 40-10 días, se recomienda que los animales se mantienen calientes. Por lo tanto, en nuestro caso, los ratones se encuentran en un gabinete de calentamiento (30 ° C + / – 1). Vigilancia de las condiciones generales y el peso corporal, comoasí como el consumo de alimentos y agua, se realiza una vez al día según el estado general y vigilancia de la salud hoja de datos (Tabla 1) durante 10 días después de la operación. Criterios de valoración humana, es decir, el sacrificio de un animal para evitar el sufrimiento innecesario y el dolor si la progresión de la recuperación es satisfactoria, se realizan bajo las siguientes condiciones: En caso de mal estado general, es decir, el animal es bastante apáticos (no hay movimiento después de haber sido tocado / difusión) y la superficie del cuerpo se siente frío a pesar del calentamiento, el animal debe ser sometido a la eutanasia de inmediato. Si, el día 4 después de la implantación del transmisor, el animal muestra signos claros de la apatía, es muy agresivo o no muestra la ingesta de alimentos, se debe practicar la eutanasia de inmediato. El día 8 después de la implantación del transmisor, el animal tiene que mostrar un claro aumento en el peso corporal en comparación con el anterior post-operatorio días. Además, se ha de consumir en lEste 80% de la ingesta de alimentos antes de la operación diaria. Si una de estas condiciones no se cumple, el animal debe ser sometido a la eutanasia de inmediato. A los 10 días después de la implantación, el animal se traslada de nuevo a la sala de animales en condiciones de alojamiento estándar. Los ratones deben ser alojados en grupos compatibles para permitir la interacción social y para prevenir los efectos adversos de largo plazo de viviendas individuales, que pueden tener un impacto sustancial en la lectura de los experimentos posteriores 8, 9. Los ratones deben tener un período de al menos 4 semanas de convalecencia después de la implantación del transmisor antes de que el primer experimento se lleva a cabo y se inicia la adquisición de datos. 4. De adquisición de datos La recolección de datos se inicia al tocar al animal con un imán, con lo cual el transmisor está encendido. Dataquest ART Software (Data Sciences International, St. Paul, MN, EE.UU.), coordina la detección, recopilación, análisis y graphical presentación (en forma de formas de onda) de las señales de uno o más animales. El programa de adquisición de datos recoge las señales enviadas a la computadora de los convertidores y los receptores a través de una matriz de intercambio de datos (Data Sciences International). Este programa puede recopilar datos para un periodo específico de tiempo a intervalos regulares o de la muestra de forma continua y guardar los datos en el disco duro del ordenador. Dado que la gama y la calidad de la señal emitida depende fuertemente de la composición material de la jaula y equipo a su alrededor (por ejemplo, metal vs plástico), se sugiere que la placa de receptor se coloca lo más cerca a los animales como sea posible, por ejemplo, bajo la jaula de los animales o por encima de la zona experimental de banco, por ejemplo, de laboratorio o en cinta. Se recomienda que la configuración correcta del sistema de transmisión de grabación y los datos se comprueba al hacer un breve examen de las mediciones en tiempo real en modo de muestreo continuo. Después de que los datos han sido recogidos y almacenados, se pueden trazarTed, que se enumeran y analizan para una variedad de diferentes parámetros mediante el programa de análisis. Los detalles de la configuración del sistema de registro (por ejemplo, la definición del modus muestreo), y software de análisis (por ejemplo, para los parámetros de variabilidad del ritmo cardíaco, PQ intervalo y el intervalo QT establecido a partir de biopotencial / ECG curvas) se pueden encontrar en los manuales del fabricante. Pistas valiosas para la planificación biométricos y los métodos estadísticos útiles para la adquisición de datos telemétricos y la interpretación son publicados en otros lugares 3. 5. Los resultados representativos: Un esquema general del procedimiento descrito se muestra en la Figura 1. La posición del transmisor implantado, incluyendo la localización de los electrodos para la obtención de biopotenciales del corazón (un ECG) se muestra en la Figura 2. Ejemplos de datos en bruto a corto plazo, las curvas de biopotencial (un ECG), y de largo plazo de la frecuencia cardíaca, temperatura central del cuerpo y las grabaciones de la actividad locomotora de los distintoslos ratones se dan en las Figuras 3 y 4, respectivamente. La Figura 5 muestra un ejemplo de los datos publicados a partir de mediciones a largo plazo en grupos de ratones después de un experimento. Otros parámetros se pueden establecer a partir de las curvas de biopotenciales. Ejemplos para la presentación de los parámetros de variabilidad del ritmo cardíaco 5, el intervalo QT y PQ intervalo de 10, 11 se han publicado en otros lugares. Tabla 1. Estado general de salud y la hoja de control de datos. Haga clic aquí para descargar la hoja. Esta plantilla facilita el seguimiento del estado general un ratón individual y la salud. Examen inicial de la apariencia de un animal, la postura y el comportamiento espontáneo, así como la determinación del peso corporal y consumo de alimentos y el agua debe ser establecida antes de la cirugía de implantación una vez al día durante 3 días. La comparación de las determinaciones basales con los obtenidosdía durante 10 días después de la cirugía sirve para evaluar la progresión de la recuperación post-operatoria. Además, el post-operatorio de atención y tratamiento del dolor están bien documentados en la forma de un expediente médico. Las instrucciones sobre criterios de valoración humana se dan con el fin de facilitar las decisiones sobre si un ratón debe ser sacrificado para evitar el dolor y el sufrimiento innecesarios si el animal no cumple los criterios para una recuperación rápida después de la implantación. Figura 1. Lista para el establecimiento de telemetría de soporte transmisor de los ratones. Orden cronológico de los procedimientos relativos a la implantación de un transmisor que muestra los momentos en los que puede ser un ratón utilizados para experimentación y adquisición de datos. Figura 2. Radiografía / croquis ubicación de la muestra Telemet implantadory transmisor. El cuerpo del transmisor se coloca en la cavidad abdominal. El cable positivo se transforma en un lazo de alambre y se fija a la apófisis xifoides con puntos de sutura. El polo negativo es un túnel subcutáneo desde el tórax hasta el cuello y se fija como un asa de alambre entre los músculos al lado de la tráquea. La radiografía se toma a partir de la publicación de los autores anteriores en 9 animales de laboratorio. Figura 3. Biopotencial curvas. Impresión de una prima de plomo curvas de ECG de un ratón y consciente del mismo animal bajo anestesia inhalatoria con sevoflurano. La frecuencia cardíaca se calcula de forma automática por el sistema de telemetría. La secuencia de 3 segundos grabados bajo anestesia indica una frecuencia cardíaca de 440 latidos por minuto. La curva registrada en el ratón consciente muestra una frecuencia cardíaca de 660 latidos por minuto, lo que cae dentro del rango esperado para la frecuencia cardíaca durante el modo detasa de actividades físicas tales como el aseo o comer. De las curvas de ECG biopotencial / un plomo, los parámetros de variabilidad del ritmo cardíaco, intervalo entre latidos, y PQ y los intervalos QT se puede establecer con el uso de software del fabricante. Figura 4. Datos en bruto a partir de mediciones a largo plazo en ratones sanos y enfermos. La frecuencia cardíaca (latidos por minuto), la temperatura corporal central (° C) y la actividad locomotora (cuentas) se mide cuando los ratones son alojados individualmente en su jaula sin ningún tipo de alteración de los procedimientos de hombre o experimental. La frecuencia cardíaca se registraron durante 30 segundos cada 5 minutos (frecuencia de muestreo de 1000 Hz). La temperatura central del cuerpo se muestra durante 10 segundos cada 5 minutos. La actividad locomotora se graba continuamente y se almacena en intervalos de 5 minutos. Cinco minutos de los puntos de datos se remontan a 6,5 ​​días. Las mediciones de telemetría se registran de tres ratones con diferentescondiciones corporales. El ratón sano muestra un ritmo circadiano claro con un aumento en los valores normales fisiológicas y de comportamiento la actividad locomotora en la oscuridad (noche) de fase. Por el contrario, después de una cirugía mayor, la frecuencia cardíaca aumenta, sobre todo en la fase de luz del día, y la actividad locomotora está deprimido. El ratón tercio sufría de la enfermedad crónica de su tumor, el ritmo circadiano de la frecuencia cardíaca y temperatura corporal central un aspecto aplanado, y la actividad locomotora disminuye. Datos representativos de las mediciones de la frecuencia cardiaca (los valores normales y después de una cirugía mayor) se han tomado de la publicación de los autores anteriores en Altex 12. Figura 5. Ejemplo de presentación de los resultados de las mediciones de telemetría a largo plazo después de un experimento. La cifra es tomada de la publicación de los autores anteriores en un animales de laboratorio. Como un experimento ejemplar, un isofl de 50 minutosanestesia urane o sevoflurano se llevó a cabo. El impacto a largo plazo de los anestésicos sobre la frecuencia cardiaca, temperatura corporal y la actividad locomotora de los animales estaban despiertos se comparó. El uso de 16 transmisores implantados los ratones, los datos de telemetría se registraron en ocho ratones por anestesia, mientras que los animales fueron alojados individualmente y se les permite vagar libremente en sus jaulas. Para el análisis de los efectos a largo plazo postanestésica, se tuvo en cuenta que los valores varían en gran medida durante un ciclo de 24 horas ya que los ratones son activos principalmente durante la noche. Por lo tanto, los medios de los valores de telemetría para cada animal se calcularon por separado para la noche (12 h oscuridad) y el día (12 horas de luz) fases. Los valores normales de un individuo se establecieron mediante el cálculo de los medios de los tres días previos a la anestesia. Por cada día después de la anestesia, la media de la fase de oscuridad y la luz se comparó con los valores normales del individuo, resultando en valores delta. Por lo tanto, los valores delta representan la desviación de los valores normales (establecido antesa la anestesia) en el correspondiente 12 días y horas de la noche. Las columnas representan la media de ocho ratones, barras indican la desviación estándar. Los asteriscos indican significación de p ≤ 0,05 (Una forma de análisis de la varianza para la comparación de medias de los grupos en cada uno de los cuatro días después de la anestesia con los valores normales).