Incapsulamento di cardiomiociti in un idrogel di fibrina per l'ingegneria tissutale cardiaca

1. Cardiomiociti neonatali isolamento – la preparazione (giorno prima) Soluzioni create in questa sezione: PBS-glucosio soluzione, stop dei media. Preparare una soluzione di PBS-glucosio con l'aggiunta di 5 ml penicillina-streptomicina (100 unità / ml e 100 mg / ml) e 1,98 g di glucosio per 250 ml 1x fosfato sterile salina tamponata (PBS) e portare il volume soluzione a 500 ml con ulteriori 1x PBS sterile. Preparare fermare i media aggiungendo 25 FBS ml e 5 ml di penicillina-streptomicina (concentrazione come sopra) a Media 250ml sterile Dulbecco Modified Eagle (DMEM) e portare il volume a 500 ml con sterili DMEM prima della filtrazione sterile attraverso un micron 0.2. Sterilizzare gli strumenti chirurgici necessari per l'isolamento in autoclave: un hemostat, # 5 pinze, forbici grandi, micro-forbici, e un manico bisturi (# 4). 2. Cardiomiociti neonatali isolamento – la preparazione (giorno di raccolta) Assicurarsi di mantenere la sterilità Soluzioni utilizzate in questa sezione: PBS-glucosio soluzione, Betadine Per ogni cucciolata, prendere i due sterili 100 millimetri piastre Petri, metterli nel cofano e riempire con ~ 10 ml di ghiacciata PBS-glucosio. Questi dovrebbero poi essere inseriti in un secchiello del ghiaccio pieno di ghiaccio nella cappa sterile cultura. Posizionare un bicchiere da 250 ml con 30-40 ml di Betadine all'interno della cappa. Aggiungere 50 mL / cucciolata di PBS-glucosio in un sigillo bottiglia, e posto in un bagno d'acqua a 37 ° C. Per ogni persona, un luogo un banco assorbente underpad sulla superficie di lavoro cappa e posizionare un telino sterile in cima facendo attenzione a non toccare l'area di lavoro centro della garza sterile. Dump gli strumenti chirurgici e una 4 x 4 garza sul telino sterile senza toccare gli strumenti. Aprire una lama sterile # 20 bisturi e scarico sul drappo, sempre facendo attenzione a non toccare con i guanti non sterili. Prendete i cuccioli dalla madre e il luogo in contenitore opaco, cuccioli posto nel cofano Indossare guanti sterili Piegare la garza in quarti, con pinza emostatica e riporre in coppa Betadine. Mettere il bisturi sul manico bisturi e mettere da parte. 3. Cardiomiociti neonatali isolamento – dissezione cuore Soluzioni utilizzate in questa sezione: Betadine, PBS-glucosio Prendete il cucciolo nella vostra mano non dominante da pizzicando la pelle tra le scapole tra il pollice e l'indice. Utilizzando le forbici grandi, decapitare il cucciolo in un unico taglio. Assicuratevi di tagliare dal retro del cucciolo in avanti, per garantire che la colonna vertebrale è completamente reciso. Tampone il cucciolo di petto con la garza imbevuta Betadine. Fissare il cucciolo pizzicando le scapole insieme. Eseguire parziale toracotomia per esporre il cuore. Aumentare la pressione applicata, costringendo il cuore oltre l'costole per la dissezione scalpular. Eseguire il bisturi dietro il cuore di tagliare grossi vasi e rimuovere il cuore. Mettere il cuore nella capsula di Petri contenente PBS-glucosio che si trova sul ghiaccio. Ripetere i passaggi 1-3 per ogni cucciolo nella lettiera. 4. Cardiomiociti neonatali isolamento – isolamento dei miociti Soluzioni create / usato in questa sezione: PBS-glucosio soluzione, soluzione collagenasi, stop soluzione Una volta che i cuori sono stati isolati, rimuovere eventuali residui di sangue e di tessuto connettivo di risciacquo in gelide soluzione di glucosio PBS, rimuovere la parte superiore 1 / 3 di cuore per isolare solo il tessuto ventricolare e posto in un piatto fresco di Petri con ghiaccio-freddo PBS glucosio, preparato in precedenza. Tritare con cura i cuori in ~ 1 mm cubo utilizzando il micro-forbici e la pinza. Prendete una pipetta sterile trasferire, tagliare la punta con le forbici in modo che la bocca della pipetta è ~ 3 mm di diametro. Usare la pipetta per trasferire i pezzi di tessuto e tutta la soluzione in un cono da 50 ml e posto sul ghiaccio. Pesare 15.000 unità per nidiata di cuccioli di tipo II collagenasi (unità / mg dipende dal lotto) e posto nella bottiglia di 37 ° C riscaldata PBS-glucosio preparato in precedenza per creare una soluzione collagenasi. Mescolare bene e filtro sterile in una bottiglia a parte. Mettere di nuovo nel bagno d'acqua a 37 ° C. Posizionare la soluzione bloccante nel bagno d'acqua a 37 ° C, come pure. Lasciare che il tessuto tritata di depositarsi sul fondo della provetta. Eliminare il surnatante finché il volume totale è di circa 10 ml. Aggiungere 7 ml di soluzione di collagenasi alla provetta. Mettere il tubo conico con i pezzi di tessuto e la collagenasi in un rack tubo su un agitatore orbitale all'interno di un incubatore a 37 ° C o in forno. Girare il agitatore orbitale a circa 60 giri e chiudere la porta. Impostare un timer per 7 minuti. Assicurarsi di posizionare il bac collagenasik nella vasca d'acqua per mantenerlo caldo. Quando il timer si spegne, portare la parte posteriore conica nel cofano. Anche portare la collagenasi caldo e fermare soluzione nel cofano. Delicatamente titolare i pezzi di tessuto 5-7 volte a rompere in su. A seguito della titolazione, permettono i pezzi di depositarsi sul fondo (2-3 minuti). Aspirare fuori come gran parte del sopranatante possibile essere molto attenti a non aspirare i pezzi di tessuto. In seguito, aggiungere 7 ml di soluzione di collagenasi per i pezzi di tessuto e il luogo di nuovo nel incubatore l'agitatore per 7 minuti. Per ogni passo rimanendo, delicatamente titolare 10 volte per rompere i pezzi di tessuto. Una volta che i pezzi di tessuto regolare, disegnare il supernatante off e raccogliere in un separato da 50 ml. Aggiungere 7 ml di collagenasi ai pezzi di tessuto e digerire ancora per 7 minuti. Al tubo surnatante, aggiungere 10 ml di soluzione di arresto con una pipetta sierologica diversa dopo ogni aggiunta di surnatante dalla digestione. Ripetere fino a quando tutti i collagenasi è stata utilizzata (7 punti in totale). Dopo la fase di digestione finale, prendere la forma conica con la soluzione di cellule e filtrare setaccio cellula 70μm in fresco conica. Spin celle in basso a 100g per 5 minuti e risospendere in 20 ml di DMEM da contare con un emocitometro, e posto le cellule in ghiaccio. Dispensare 50 l di cellule in una soluzione Tricloroetano (75 microlitri Tricloroetano, 125 microlitri di PBS), mescolare bene prima di mettere 10 microlitri nel emocitometro per il conteggio. Cellule vive sono chiare, mentre le cellule morte sono blu. Si aspettano circa 3 milioni di cellule per topo cucciolo, con agibilità di circa 80-90%. 5. Casting costruisce gel di fibrina – preparazione per la creazione di fibrina gel (fatto con largo anticipo) Soluzioni create in questa sezione: Soluzione fibrinogeno, trombina soluzione madre, Pluronics soluzione, del miocardio mezzi costruire. Preparare un 33 mg / ml soluzione madre di fibrinogeno nel buffer mm 20 HEPES in soluzione salina 0,9% dal fibrinogeno lentamente, mescolando in soluzione salina tamponata HEPES per diverse ore a 37 ° C. Lasciare che la soluzione riposare una notte a 2-8 ° C. Riscaldare la soluzione a 37 ° C. La soluzione è sterile filtrata attraverso una serie di filtri consecutivi: 40 filtri cellule micron, 0,45 micron bottiglia filtri top con vetro pre-filtri, e 0,2 micron bottiglia filtri top con vetro pre-filtri. La soluzione è aliquotati in 1 ml e 3 ml aliquote e conservati a -20 ° C. Preparare un 25 U / mL soluzione di riserva della trombina con l'aggiunta di 500 U di trombina a 18 mL di soluzione salina allo 0,9% e 2 ml di acqua deionizzata sterile, filtro sterile attraverso un filtro di 0,2 micron, aliquota in 500 microlitri e 250 microlitri aliquote e congelare a -80 ° C. Preparare un 5% w / v Pluronics F-127 soluzione, sciogliendo 50 g di Pluronics F-127 a 700 ml di acqua deionizzata. Portare il volume soluzione fino a 1 litro con l'aggiunta di acqua deionizzata. Filtro sterili con filtro da 0,2 micron. La soluzione Pluronics può essere utilizzato fino a tre volte prima di sostituire, se filtrato sterile dopo ogni utilizzo. Preparare miocardico costruire mezzi di comunicazione con l'aggiunta di 10% siero di cavallo, 2% di siero fetale bovino, 1% di penicillina-streptomicina, e 6 mg / mL-aminocaproico acido in DMEM. 50 mg / ml di acido ascorbico e 2 mg / ml di insulina in 25 mM HEPES devono essere aggiunti immediatamente prima della somministrazione. Montare mandrino mettendo insieme uno stelo in teflon, una manica di teflon, due rondelle in teflon con una tacca rimosso per scopi di iniezione, e due o-ring in gomma (vedi Figura 2a). Autoclave prima dell'uso. Prendere involucri siringa 6cc per la parte esterna dello stampo e involucri siringa 3cc per essere usato come pistoni, e li prepara tagliando il luer-lock e termina in autoclave (vedi Figura 2a). 6. Casting costruisce gel di fibrina – preparazione per la creazione di gel di fibrina (a destra prima di fare i costrutti gel di fibrina) Soluzioni utilizzate in questa sezione: soluzione Pluronics Filtro sterile il 5% Pluronics F-127 con una soluzione di 0,2 micron filtro prima dell'uso. Mandrini luogo e involucri siringa nel 5% Pluronics soluzione in un bicchiere 1 L nel cappuccio. Lasciare le parti immersi nella soluzione Pluronics per 2-3 ore nel cappuccio per garantire la verniciatura completa. La soluzione Pluronics ricopre i mandrini e impedisce il gel di fibrina di aderire alla mandrini. Dopo l'incubazione di 2-3 ore, versare la soluzione al 5% Pluronics nella bottiglia, luogo teleria sterile sulla superficie del cofano ed indossare guanti sterili per costruire gli stampi. Posizionare il mandrini costruiti in 6 involucri cc siringa, con la siringa 3cc come un pistone per garantire una tenuta ottimale tra gli o-ring e le rondelle in teflon. 7. Casting fibrina gel costruisce tramite stampaggio ad iniezione Soluzioni create in questa sezione: la soluzione F, soluzione T, soluzione delle cellule. Per fare 1 ml di gel di fibrina (3,3 mg / ml concentrazione di fibrinogeno finale, 25 U / mL concentrazione finale trombina), creare F soluzione in un tubo conico, con l'aggiunta di 112 ml di stock fibrinogeno a 558 l di tampone di mm 20 a HEPES 0,9% soluzione salina. In un tubo a parte conica, creare una soluzione di T con l'aggiunta di 17 ml di stock trombina, e 1,3 l di 2 N Ca + + soluzione a 135 ml di DMEM. Vedi Tabella 1. In un terzo tubo conico, preparare una soluzione di cellule riducendo la velocità delle cellule e risospendere le cellule in un volume in modo che la concentrazione di cella è 29,4 milioni cellule / ml o 6 volte la concentrazione della concentrazione finale desiderata di cellule nel costrutto Quando si è pronti per lanciare la fibrina gel di costruzione, preparazione una siringa da 1 ml con una 18G 1 ½ pollice lungo ago. Hanno un ago 21G 1 pollice pronto pure. La soluzione di fibrina è creato un rapporto 04:01:01 di soluzione F: T soluzione: la soluzione delle cellule. Per fare un ml di gel, aggiungere 667 ml di soluzione di F in una provetta pulita centrifuga da 50 ml, seguita da 167 ml di soluzione delle cellule, e infine aggiungere 167 ml di soluzione di T. Pipetta di mescolare insieme la soluzione facendo attenzione a non introdurre bolle. Una volta che le soluzioni sono misti, la reazione è iniziato e l'iniezione dei costrutti dovrebbe essere fatta immediatamente. Prendere la siringa precedentemente preparata con l'ago 18G ed elaborare soluzioni fibrina. Fare attenzione a non invertire la siringa per evitare le bolle di entrare nella ago. Sostituire l'ago 18G con un ago 21G. Toccare delicatamente siringa per costringere le bolle d'aria. Inserire siringa nello stampo tra il tappo e rivestimento in seguito alla scanalatura del Teflon O-ring e iniettare la soluzione nello stampo. Inclinare lo stampo con la scanalatura sulla parte superiore per assicurare il riempimento completo. Rimuovere la siringa e continuano a riempire gli stampi rimanenti. Soluzione di gel sufficiente possono essere creati per riempire gli stampi diversi allo stesso tempo. Tuttavia, poiché la soluzione gel rapidamente, è generalmente una buona idea per limitare il numero dei costrutti iniettato in un dato momento a 6. Avvolgere gli stampi in Parafilm in gruppi di tre e mettere in incubatore o forno a 37 ° C. Lasciare che il gel per incubare negli stampi per 20 minuti per permettere al gel di polimerizzare. Riempire ogni vasetto cultura (Nalgene rettilineo lato barattolo) con 21 ml di miocardico medio costruire per costruire. Utilizzare la siringa da 3 cc sterile involucro come un pistone per forzare il mandrino con il costrutto in un grande piatto di Petri con DMEM. Poi posto il costrutto nel barattolo campione. Ogni vasetto 16 oz può contenere fino a 6 costruzioni, mentre ogni 4 oz vaso può contenere 2. Avvitare le protezioni alle vasi e trasferirli al incubatrice. All'interno dell'incubatore, allentare le protezioni alle giare per consentire lo scambio di gas. Dopo 24 ore, prendere un pick sterile dentale e spingere il costrutto di distanza dal teflon bianco O-ring alle estremità dello stampo ad anello per garantire l'allineamento uniforme del costrutto (vedi figura 2 risultati rappresentativi). 8. Tecniche di analisi (dopo 2 settimane di cultura) – forza di test contrazione Soluzioni utilizzate in questa sezione: DMEM, infarto costruire mezzi di comunicazione. Bloccare il coccodrillo sul cavo proveniente dal stimolatore per i fili degli elettrodi nella vasca da bagno. Alimentare la scheda di acquisizione dati, generatore di impulsi, e trasduttore di forza. Il trasduttore di forza dovrebbe essere commutato l'impostazione 5g e azzerato. Aprire un programma personalizzato LabView che visualizza e salva i dati dal trasduttore di forza. Creare un nuovo file di testo vuoto nella cartella di dati per ogni campione. Luogo in DMEM 37 ° C acqua del bagno e lasciare il tempo che si riscaldi prima prova i costrutti. Una volta riscaldato, posto a 37 ° C DMEM nel bagno medio del sistema di misurazione della forza (vedi figura 3A). Rimuovere il costrutto dal vaso campione facendo scorrere delicatamente l'anello di costruire da supporto in teflon con le pinzette e il luogo del costrutto sopra il perno di metallo fissata nella vasca da bagno forza media sistema di misurazione. Non afferrare il costrutto con le pinzette! Piuttosto, utilizzare le pinzette per spingere e sollevare il costrutto fuori del supporto mandrino. Posizionare l'altra estremità del costrutto sul braccio del trasduttore e stringere fino a quando il trasduttore legge 0.50V, (circa 1,0 grammi forza o 10 millinewtons di tensione) Selezionare il file di testo per i dati di forza della contrazione da registrare in. Sul stimolatore cardiaco (Model # S88X, Tecnologie Erba), impostare la tensione di impulso a 20V (8 V / cm), durata 6 ms, e un tasso di 1 Hz. Avviare la stimolazione elettrica premendo il tasto "uscita on / off" pulsante Avviare la registrazione fino a quando diventa forma d'onda regolare. Rimuovere con attenzione il costrutto dal bagno forza media sistema di misurazione e rimetterla in mezzo di coltura. Quindi rimuovere il DMEM dal bagno forza media sistema di misurazione e sostituirlo con fresco, caldo DMEM per analizzare additcampioni ionale. Tagliare il costrutto e srotolare in modo che si può misurare la lunghezza e la larghezza del costrutto Tagliare il costrutto in sezioni da utilizzare per misure aggiuntive, tra cui l'analisi fattibilità, istologia, o misure Western Blot. 9. Tecniche di analisi (dopo 2 settimane di cultura) – Live-Dead saggio di redditività (con Invitrogen Live / Dead Assay) 14: Le soluzioni utilizzate in questa sezione: EthD-1 soluzione madre, calceina AM magazzino soluzione PBS Lavare i campioni con 3x lava 5 minuti in PBS. Aggiungere 20 ml di 2 mM EthD-1 soluzione madre a 10 ml di PBS sterile e vortex per garantire la omogeneizzazione della miscela. Aggiungere 5 ml di 4 mM calceina AM stolution stock EthD-1 soluzione. Ancora una volta, vortice per assicurare un completo mixaggio. Aggiungere abbastanza volume della soluzione di cui sopra per coprire il costrutto. Incubare coperto (per evitare photobleaching dei coloranti) per 30 minuti a temperatura ambiente. Rimuovere i coloranti e sostituirlo con caldo PBS. Osservare e registrare le immagini con un microscopio a fluorescenza. Calceina è eccitato dalla luce 494 nm ed emette luce 517 nm, mentre etidio omodimero-1 è di 528 nm ed emette luce luce 617 nm. Figura 4 risultati del campione. 10. Tecniche di analisi (dopo 2 settimane di cultura) – immunoistochimica per importanti proteine ​​miociti: Soluzioni utilizzate in questa sezione: PBS, il 4% paraformadehyde in PBS, siero asino 5% in PBS, gli anticorpi in PBS, 0,1 ng / mL di Hoechst 33258 in PBS. Lavare i campioni con 3x lava 5 minuti in PBS. Fissare con paraformaldeide 4% in soluzione PBS, per 2-3 ore a 4 ° C Lavare i campioni con 3x lava 5 minuti in PBS. Il campione può ora essere integrata, sezionati e colorati secondo il protocollo di scelta. La restante parte di questo protocollo copre tutta la colorazione costruire per l'imaging con microscopia confocale. Si noti che i tempi di incubazione è più lunga di quella per il tessuto sezionato come c'è bisogno di più tempo per gli anticorpi per diffondere nel costrutto. Inoltre, tutti i passaggi rimanenti sono condotte a temperatura ambiente. Aggiungere 0,1% Triton-X in PBS ai campioni per 30 minuti a permeabilize le membrane cellulari. Lavare i campioni con 3x lava 10 minuti in PBS. Aggiungi siero asino 5% in PBS per i campioni per 1 ora e mezza di bloccare qualsiasi legame non specifico degli anticorpi secondari ai campioni. Aggiungi connessina 43 (diluizione 1:50) e la catena pesante della miosina (1:100 diluizione) anticorpi primari in PBS ai campioni per 3 ore. Al fine di un'etichetta entrambe le proteine ​​consecutivamente è necessario assicurarsi che gli anticorpi primari sono da diversi host (cioè coniglio e mouse). Lavare i campioni con 3x lava 10 minuti in PBS. Aggiungere il appropriati anticorpi fluorescente secondaria in PBS per 3 ore. Lavare i campioni con 3x lava 10 minuti in PBS Poco prima di imaging dei campioni al microscopio confocale, aggiungere 0,1 ng / ml Hoechst 33258 in PBS per 15 minuti. Lavare i campioni con 3x lava 10 minuti in PBS. Analizzare l'espressione campioni di MHC e Cx43 per immagini le cellule con un microscopio confocale (Figura 4 risultato esempio). 11. Risultati rappresentativi / Risultati: I cardiomiociti fibrina costruire inizialmente copre tutta la larghezza dello stampo (Figura 2B). Bolle dovrebbe esistere nel costrutto e dovrebbe aspetto uniforme su tutta la lunghezza. Dopo due settimane di coltura, il contratto di costruzione per circa 1 / 4 della larghezza iniziale (Figura 2C). Quando il costrutto è elettricamente ritmo nel nostro dispositivo personalizzati forza di contrazione (Figura 3A), i dati forza contrazione possono essere generati come mostrato nella Figura 3B. La forma d'onda può essere analizzato separatamente in MATLAB (MathWorks) per determinare la forza, il tasso di contrazione, e il tasso di relax. Le forze di contrazione di circa 1,3 milioni sono previsti 6. Vitalità cellulare del costrutto dipende dalla profondità del costrutto, a causa dei limiti alla diffusione di ossigeno nel costrutto. Sulla superficie del costrutto, 4A, la vitalità cellulare alto si osserva. Con la microscopia confocale, figura 4B, la struttura allineata del costrutto si osserva a causa della catena pesante della miosina, MHC, è importante per la contrazione, in rosso. Connessina 43, in verde, è necessario per l'accoppiamento tra cellulari miociti. Figura 1: Panoramica del processo di incapsulamento Figura 2: A) le parti dello stampo separati e combinati per la creazione di gel di fibrina. Indietrom da sinistra a destra: due rondelle in teflon, due o-ring in silicone, una canna da Teflon, un tubo in Teflon, un mandrino completato, il rivestimento esterno per il mandrino, e lo stantuffo). B) Costruire il stampo subito dopo l'espulsione dalla parte esterna (giorno 0). C) costruire compattato in forma (freccia rossa), a seguito di 13 giorni di cultura. Figura 3: A) personalizzati forza di contrazione del sistema di misura per la forza di registrazione contrazione. Un trasduttore di forza con un post misura la forza di contrazione e visualizza i risultati in un computer. Un bagno contenente due elettrodi di carbone con fili si collega a uno stimolatore elettrico che passi il costrutto. I due messaggi tenere premuto il costruire al suo posto. B) Esempio di forme d'onda contrazione forza generata con la stimolazione elettrica a 0,5 Hz. Figura 4: A) saggio Live / Dead di costruire, giorno 13 (scala bar = 400 micron). Verde rappresenta le cellule vive e rosso rappresenta le cellule morte. B) Immagine confocale della catena pesante della miosina (rosso), connessina 43 (verde) e Hoescht nucleare macchia (blu) (scala bar = 10 micron). F soluzione T soluzione Soluzione delle cellule Fibrinogen 112 microlitri Trombina 17 microlitri Cellule in DMEM 170 microlitri HEPES 558μl Ca + + 1,3 microlitri DMEM 152 microlitri Totale 670 microlitri Totale 170 microlitri Totale 170 microlitri Tabella 1. Gel di fibrina soluzioni, quantitativi per 1 ml di gel. Nota: Fibrinogen = 33 mg / mL fibrinogeno in 20 mM HEPES tamponata Saline HEPES = 20 mM HEPES salina tamponata Trombina = 25 U / mL soluzione in soluzione 0,81% di NaCl Ca + + = 2 N soluzione di cloruro di calcio