Kalp Doku Mühendisliği Fibrin Hidrojel kardiyomiyositlerinin Kapsülleme

1. Yenidoğan kardiyomiyosit izolasyon – Hazırlık (gün önce) Bu bölümde oluşturulan Çözümler: PBS-Glukoz çözeltisi, medya durdurun. Penisilin-streptomisin (100 ünite / ml ve 100 mg / ml) ve 1.98 g glukoz 250 ml 1x steril fosfat tamponlu salin (PBS) 5 ml ekleyerek bir PBS-glukoz çözeltisi hazırlayın ve ek hacmi 500 ml çözüm getirmek steril PBS 1x. 250ml steril Dulbecco'nun Kullanıcı Modifiye Kartal Kullanıcı Orta (DMEM) 25 ml FBS ve penisilin-streptomisin 5 ml (yukarıda olduğu gibi aynı konsantrasyon) ekleyerek durdurmak ortamı hazırlayın ve bir 0.2 mikron filtre ile steril filtreleme önce steril DMEM ile 500 ml hacmi getirmek. Otoklavlayarak izolasyonu için gerekli cerrahi aletler sterilize: hemostat # 5 forseps, büyük makas, mikro-makas, neşter sapı (# 4). 2. Yenidoğan kardiyomiyosit izolasyon – Hazırlık (hasat gün) Kısırlık korumak için emin olun Bu bölümde kullanılan Çözümleri: PBS-glukoz çözeltisi, Betadine Her çöp için, iki steril 100 mm petri kaplarına Kaputun koyun ve buz PBS-glukoz ~ 10 ml ile doldurun. Bunlar daha sonra steril kültür kaputu buz dolu bir buz kovası içinde yer almalıdır. Kaputun Betadine 30-40 ml ile 250 ml beher yerleştirin. 37 ° C su banyosu içine bir şişe, mühür ve yerine 50 mL / çöp PBS-şekeri ekleyin. Her bir kişi için, kaput çalışma yüzeyine underpad emici bir tezgah yeri ve steril steril örtüyü merkezi çalışma alanı dokunmamaya dikkat ederek bir üst örtüyü yere. Aletlerin dokunmadan steril örtüyü üzerine cerrahi aletler ve 4 x 4 gazlı bez dökümü. Tekrar non-steril eldiven ile dokunmamaya dikkat ederek, örtüyü üzerine steril bir # 20 neşter bıçak ve dökümü açın. Kaputun opak konteyner, yer yavrular içine baraj yeri ve yavrular çekin Steril eldiven giyin Dörtte içine gazlı bez katlayın, Betadine behere hemostat ve yer ile kelepçe. Neşter bıçak neşter sapı üzerine koyun ve bir kenara koyun. 3. Yenidoğan kardiyomiyosit izolasyonu – kalp diseksiyonu Bu bölümde kullanılan Çözümleri: Betadine, PBS-glukoz çözüm Non-dominant el başparmak ve işaret parmağı arasında kürek kemikleri arasındaki kıstırma cilt tarafından yavru Pick up. Büyük makas kullanarak, bir kesim, yavru başını kesmek. Yavru ileri geri kesmek için, omurganın tamamen kesilmiş olduğundan emin olmak için emin olun. Swab betadin batırılmış gazlı bez ile yavru göğüs. Omuzunuzun kısma yavru sabitleyin. Kalp maruz kısmi torakotomi gerçekleştirin. Böylece scalpular diseksiyon için kaburga geçmiş kalbi zorlayarak, uygulanan basınç artırın. Kalp, büyük damarlar sever ve kalp kaldırmak için arkasında neşter bıçak çalıştırın. Kalp buz üzerine PBS-glukoz içeren petri yerleştirin. Çöp her yavru için 1-3 arasındaki adımları tekrarlayın. 4. Yenidoğan kardiyomiyosit izolasyon – miyosit izolasyon Bu bölümde kullanılan / Çözümler: PBS-glukoz çözeltisi, kollajenaz çözüm, çözüm durdurmak Kalpleri izole edildikten sonra, buz gibi soğuk PBS glukoz çözeltisi durulama herhangi bir kalıntı kan ve bağ dokusu kaldırmak, buz gibi taze bir petri içine sadece ventrikül yeri doku ve izole etmek için kalbin üst 1 / 3 kaldırmak PBS glikoz, önceden hazırlanmış. Mikro-makas ve forseps kullanarak ~ 1 metreküp mm dikkatle kalpleri kıyma. , Steril bir transfer pipeti pipetin ağız çapı 3 mm, böylece makas kullanarak ucu kesilmiş. 50 ml konik ve buz üzerinde yer çözüm doku parçaları ve tüm aktarmak için pipet kullanın. 37 şişeye tip II kollajenaz yavrular, çöp başına 15.000 birim (ünite / mg çok bağlıdır) ve yer tartılır ° C PBS-glukoz kollajenaz çözüm oluşturmak için önceden hazırlanmış ısıttı. Ayrı bir şişeye iyi ve steril filtre karıştırın. 37 ° C su banyosu içine yerleştirin. Stop çözüm de 37 ° C su banyosu içine yerleştirin. Kıyılmış doku santrifüj tüpüne alt yerleşmek için izin verin. Toplam hacim 10 ml kadar süpernatantı. 7 ml santrifüj tüpüne kollajenaz çözüm ekleyin. Konik tüp doku parçaları ve bir tüp 37 ° C inkübatör veya fırın içinde bir orbital çalkalayıcı rafın içine kollajenaz koyun. Yaklaşık 60 rpm'de orbital çalkalayıcı açın ve kapağını kapatın. 7 dakika için bir zamanlayıcı ayarlayın. Kollajenaz bac yere emin olun.k sıcak tutmak için su banyosu içine. Zamanlayıcı çaldığında, kaput içine konik geri getirmek. Ayrıca sıcak kollajenaz kaput haline getirmek ve çözüm durdurmak. Yavaşça doku parçaları, onları yıkmak için 5-7 kez titre. Titrasyon yapıldıktan sonra parçalar altındaki (2-3 dakika) yerleşmek için izin verir. Doku parçalarını emmek için çok dikkatli olmak kadar süpernatant mümkün aspire. Daha sonra, 7 ml kollajenaz çözüm doku parçaları ekleyin ve 7 dakika çalkalayıcı kuvöz içine geri koyun. Kalan her adım için, yavaşça doku parçalarını kırmak için 10 kat titre. Sonra doku parçaları, yerleşmek süpernatantı çekişi ve ayrı bir 50 ml konik toplamak. Kollajenaz, 7 ml doku parçaları ekleyin ve 7 dakika için tekrar sindiremez. Supernatant tüp için, sindirim süpernatant her eklenmesinden sonra farklı bir serolojik pipet yardımıyla 10 ml durak çözüm ekleyin. Kollajenaz (toplam 7 adım) kadar tekrarlayın. Son sindirim adımdan sonra, taze konik 70μm hücre elekten hücre çözümü ve filtre ile konik alır. 5 dakika 100g hücreleri aşağı Spin ve hemasitometre kullanarak sayılabilir DMEM 20 ml tekrar süspansiyon ve buz üzerinde hücreleri yer. Yeri Tripan Blue çözüm (75 ul Tripan Mavi, 125 ul PBS) içine hücrelerin 50 ul, sayım için 10 ul hemasitometre yerleştirmeden önce iyice karıştırın. Canlı hücreleri, ölü hücreler mavi ise açıktır. Yaklaşık% 80-90 oranında bir canlılığı ile yavru sıçan başına yaklaşık 3 milyon hücre bekliyoruz. 5. Döküm fibrin jel oluşturur fibrin jeller (önceden yapılır) oluşturmak için hazırlık Çözümler Bu bölümde oluşturulan, fibrinojen stok solüsyonu, trombin stok çözüm, Pluronics çözüm, miyokard inşa medya . Hepes içine yavaş yavaş karıştırma fibrinojen tuzlu% 0.9, 20 mM HEPES tamponu fibrinojen 33 mg / ml stok solüsyonu hazırlayın 37 birkaç saat içinde tamponlu salin ° C Çözüm 2-8 gecede yerleşmek için izin ver ° C 37 ° C'ye kadar çözüm Sıcak Çözüm steril bir dizi ardışık filtreler süzgecinden: 40 mikron hücre süzgeçler, 0.45 mikron şişe cam ön filtreler ile filtreler, ve 0.2 mikron şişe cam ön filtreler ile üst filtreler. Çözüm 1 ml ve 3 ml alikotları aliquoted ve -20 ° C'de saklanır 0.2 mikron filtre, bir kısım üzerinden 500 ul ve 250 ul alikotları ve donma içine trombin 500 U 18 mL% 0.9 serum fizyolojik ve 2 mL steril deiyonize su, steril filtre ekleyerek trombin 25 U / mL stok çözelti hazırlayın -80 ° C 50 Pluronics F-127 g, 700 mL deiyonize su eriterek,% 5 w / v Pluronics F-127 çözümü hazırlayın. Ek deiyonize su ile çözüm hacim 1L getirin. Steril filtre 0.2 mikron filtre ile. Pluronics çözümü, her kullanımdan sonra steril süzülmüş değiştirmeden önce üç kez kullanılabilir. % 10 at serumu,% 2 fetal sığır serumu,% 1 penisilin-streptomisin ve 6 mg / mL-aminocaproic asit DMEM içine ekleyerek miyokard inşa ortamı hazırlayın. 50 mcg / ml askorbik asit ve 2 mcg / ml insülin 25 mcM Hepes beslemeden önce hemen eklenmesi gerekir. Mandrel birlikte bir teflon çubuk, bir teflon kol, enjeksiyon amaçları için çıkarılan bir çentik ile iki teflon pullar ve iki lastik O-ring (bkz. Şekil 2a) koyarak birleştirin. Kullanmadan önce Otoklav. Dış parçası için kalıp ve pistonları olarak kullanılmak üzere 3cc'lik şırınga muhafazaları 6cc şırınga gazino alın ve Luer-lock uçlarını keserek ve otoklav (bkz. Şekil 2a) hazırlamak. 6. Döküm fibrin jel oluşturur fibrin jeller oluşturmak için hazırlık (sağ fibrin jel oluşturur yapmadan önce) Bu bölümde kullanılan Çözümleri: Pluronics çözüm Steril filtre% 5 Pluronics kullanmadan önce filtre 0.2 mikron ile F-127 çözümü. 1 L beher% 5 kaputu Pluronics çözüm içine yerleştirin Milleri ve şırınga kılıflar. Kaputun 2-3 saat için Pluronics çözüm iliklerine parçaları tam bir kaplama sağlamak için bırakın. Pluronics çözümü kat Milleri ve fibrin jel Şemsiyeler yapışmasını önler. 2-3 saat inkübasyondan sonra, tekrar şişeye% 5 Pluronics çözüm dökün, kaputun yüzey steril örtüler yerde ve kalıplar oluşturmak için steril eldiven giyin. O-ring ve Teflon pullar arasında sıkı bir mühür sağlamak için bir piston gibi 3cc'lik şırınga kullanarak, inşa Milleri 6 cc şırınga kılıflar içine yerleştirin. 7. Döküm fibrin jel enjeksiyon yoluyla yapıları Çözümler Bu bölümde oluşturulur: F çözüm, T çözüm, hücre çözümü. 1 ml (3.3 mg / ml son fibrinojen, 25 U / mL son trombin konsantrasyonu) fibrin jel yapmak için, 20 mM HEPES Tampon 558 ul fibrinojen stokunun 112 ul ekleyerek, konik bir tüp F çözüm oluşturmak % 0.9 salin solüsyonu. Ayrı bir konik tüp, trombin stokunun 17 ul ve 2 N Ca 1.3 ul ekleyerek T çözüm oluşturmak + + DMEM 135 ul çözüm. Tablo 1'e bakınız. Üçüncü bir konik tüp olarak inşa hücre konsantrasyonu, 29,4 milyon hücre / mL ya da 6 kez hücre istenilen nihai konsantrasyon konsantrasyon olduğunu, böylece bir birim hücreleri aşağı iplik ve hücrelerin resuspending bir hücre çözümü hazırlamak Fibrin jel yapısı, hazırlık 18G 1 ½ inç uzunluğunda iğne ile 1 ml şırınga atmak için hazır olduğunuzda. 21G 1 inç iğne de hazır bulundurun. Hücre çözümü fibrin çözüm: T çözüm: F çözüm 04:01:01 oranında oluşturulur. Bir mL jel yapmak için, 167 hücre çözümü mcL, ve son olarak 167 ul T çözüm temiz bir 50 ml santrifüj tüp, 667 F çözüm mcL ekleyin. Pipet kabarcıkları tanıtmak için dikkatli olmak birlikte çözüm karıştırmak için. Çözümler karıştırılır sonra, reaksiyon başlamış ve yapıları enjeksiyon derhal yapılmalıdır. 18G iğne ile önceden hazırlanmış şırınga alın ve fibrin çözüm hazırlamak. Şırınga, iğne biniyorlar kabarcıklarını engellemek için ters değil dikkat edin. 18G iğne 21G iğne ile değiştirin. Şırınga hava kabarcıkları çıkmaya zorlamak için hafifçe dokunun. Teflon O-ring oluk aşağıdaki stoper ve gövde arasında kalıp içine şırınga takın ve çözüm kalıp içine enjekte edilir. Tam dolum sigortalamak için üstüne oluk kalıp yatırın. Şırınga çıkarın ve kalan kalıp doldurmak için devam edin. Yeterli jel solüsyonu, aynı zamanda çeşitli kalıplar doldurmak için oluşturulabilir. Çözüm hızla jel Ancak, genellikle 6 ila belirli bir zaman enjekte yapıları sayısını sınırlamak için iyi bir fikir. 37 üç grupları ve inkübatör veya fırın yer Parafilm kalıpları sarın ° C, jeller, jel süresi polimerize izin, 20 dakika boyunca kalıpları inkübe izin ver. 21 ml başına miyokard yapı inşa orta her kültür kavanoz (Nalgene düz tarafı kavanoz) doldurun. DMEM ile büyük bir petri içine inşa mandrel zorlamak için bir piston gibi gövde 3 cc steril şırınga kullanın. Sonra inşa örnek kavanoza yerleştirin. Her 4 oz kavanoz 2 basılı tutabilirsiniz Her 16 oz kavanoz, 6 yapıları tutabilir. Kavanoz kapakları Vida ve inkübatör aktarabilirsiniz. Inkübatör içinde, gaz değişimi için izin kavanoz kapaklarını gevşetin. 24 saat sonra, steril bir diş al ve (Şekil 2 temsilcisi sonuçları) inşa tekdüze uyum sağlamak için halka kalıp ucunda beyaz teflon O-ring uzak inşa itin. 8. Analiz teknikleri (2 hafta sonra kültür) – kasılma gücü testi Bu bölümde kullanılan Çözümleri: DMEM, miyokard inşa medya. Kurşun banyo elektrotlar stimülatör kablolara gelen timsah tutturun. Veri toplama tahtası, darbe jeneratörü ve kuvvet dönüştürücü güç verin. Kuvvet dönüştürücü 5g ayar anahtarlı ve zeroed olmalıdır. Kuvvet dönüştürücü verileri görüntüler ve kaydeder özel bir LabView programını açın. Her numune için veri klasöründe yeni bir boş metin dosyası oluşturun. DMEM 37 ° C su banyosu içine yerleştirin ve yapıları test etmeden önce ısınmak için zaman tanıyın. Isındı sonra, 37 ° C DMEM kuvvet ölçüm sistemi orta hamamı (bkz. Şekil 3A). Örnek kavanoz inşa hafifçe cımbız ile Teflon destek yapı halkasını çıkarın ve kuvvet ölçüm sistemi orta banyosunda sabit metal yazılan üzerinde inşa yerleştirin. Cımbız ile inşa tutmayın! Aksine, itmek için cımbız kullanın ve mandrel destek inşa kaldırın. Transdüser kolu üzerinde inşa diğer ucunu yerleştirin ve transdüser 0.50V okur kadar (yaklaşık 1.0 gram kuvvet veya gerginlik 10 millinewtons), sıkın Kaydedilebilir kasılma gücü veriler için metin dosyasını seçin. Kardiyak stimülatör (Model # S88X Grass Technologies), 20V (8 V / cm), 6ms süresi ve 1 Hz bir oranda darbe gerilimini ayarlamak. "Açma / kapama düğmesi çıktı" acil elektrik pacemaker Başlat Dalga şekli düzenli hale gelinceye kadar kaydetmeye başlayın. Kuvvet ölçüm sistemi orta banyo dikkatlice inşa kaldırmak ve kültür ortamı içine yerleştirin. Sonra kuvvet ölçüm sistemi orta banyo DMEM kaldırmak ve addit analiz etmek için taze, sıcak DMEM ile değiştirinional örnekleri. Kesme ve yapı, yapı, uzunluk ve genişlik ölçmek, böylece o Penis Canlılığı, histoloji, ya da western blot ölçümleri de dahil olmak üzere ek bir analiz ölçümleri için kullanılmak üzere inşa bölüme kesin. 9 – Analiz teknikleri (2 hafta sonra kültür) – canlılığı için Canlı Dead Assay (Invitrogen Ölü / Canlı Testi) 14: Bu bölümde kullanılan Çözümleri: EthD-1 stok solüsyonu, Calcein AM stok solüsyonu PBS Örnekleri PBS içinde 3x 5 dakika yıkama ile durulayın. Tam karıştırma sağlamak için 2 mM 10 ml steril PBS ve vorteks EthD-1 stok solüsyonu 20 ul ekleyin. Calcein EthD-1 çözümü AM stok stolution 4 mM 5 ul ekleyin. Yine, iyice karışmasını sağlamak için vorteks. Yapı karşılamak için yukarıdaki çözüm yeterli hacim ekleyin. Oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin (boyalar photobleaching önlemek için) kaplı. Boyaları çıkarın ve sıcak PBS ile değiştirin. Gözlemleyin ve floresan mikroskobu ile görüntüleri kaydetmek. Calcein ethidium homodimer-1, 528 nm ışığı ve 617 nm ışık yayar, 494 nm ışık heyecanlı ve 517 nm ışık yayar. Örnek sonuçları için Bkz: Şekil 4. 10 Analiz teknikleri (2 hafta sonra kültür) – önemli miyosit proteinler için immünhistokimya: Bu bölümde kullanılan Çözümleri: PBS, PBS içinde% 4 paraformadehyde, PBS içinde,% 5 eşek, serum, PBS, 0.1 ng / ml Hoechst 33.258 PBS içinde antikorlar . Örnekleri PBS içinde 3x 5 dakika yıkama ile durulayın. 4 PBS solüsyonunda 2-3 saat% 4 paraformaldehid Fix ° C Örnekleri PBS içinde 3x 5 dakika yıkama ile durulayın. Örnek seçim protokole göre kesitli ve lekeli, gömülü olabilir. Bu protokolün kalan kısmı konfokal mikroskobu ile görüntüleme için tüm yapı boyama kapsar. Yapı içine diffüz antikorları için daha fazla zamana ihtiyaç var gibi inkübasyon sürelerinde kesitli doku için daha uzun olduğunu unutmayın. Buna ek olarak, kalan adımları tüm oda sıcaklığında yapılmaktadır. Hücre zarları permeabilize 30 dakika örnekleri PBS içinde% 0.1 Triton-X ekleyin. Örnekleri PBS içinde 3x 10 dakikalık yıkama ile durulayın. Örnekleri ikincil antikor herhangi bir non-spesifik bağlama engellemek için 1 ½ saat örnekleri PBS içinde% 5 eşek serum ekleyin. Konneksin 43 (1:50 seyreltme) ve miyozin ağır zincir (1:100 seyreltme) 3 saat örnekleri PBS primer antikorlar ekleyin. Size iki proteinleri etiket sırasına göre primer antikorlar farklı bilgisayarlardan (yani tavşan ve fare) olduğundan emin olmak gerekir. Örnekleri PBS içinde 3x 10 dakikalık yıkama ile durulayın. 3 saat PBS içinde uygun floresan etiketli sekonder antikor ekleyin. PBS içinde 3x 10 dakikalık yıkama örnekleri durulayın Sadece görüntüleme önce konfokal mikroskop örnekleri, 15 dakika için 0.1 ng / ml PBS Hoechst 33.258 ekleyin. Örnekleri PBS içinde 3x 10 dakikalık yıkama ile durulayın. Konfokal mikroskop ile görüntüleme hücreleri (örneğin sonuç için Bkz: Şekil 4) tarafından MHC ve Cx43 örnekleri ifade analiz edin. 11. Temsilcisi sonuçları / Çıktıları: Kardiyomiyosit fibrin inşa başlangıçta tüm kalıp genişliği (Şekil 2B) kapsar. Kabarcıkları yapı var ve tüm uzunluğu boyunca homojen görünmelidir. Kültür iki hafta sonra, ilk genişliği (Şekil 2C) yaklaşık 1 / 4 yapı sözleşme. Şekil 3B gösterildiği gibi inşa bizim özel kasılma gücü cihazı (Şekil 3A) elektrikle tempolu, seğirme gücü verileri oluşturulabilir. Dalga şekli, kuvveti, kasılma hızı ve gevşeme oranı belirlemek için MATLAB (MathWorks) ayrı ayrı analiz edilebilir. Yaklaşık 1.3 mN Twitch kuvvetleri 6 bekleniyor. Hücre canlılığı, yapı, yapı içine oksijen difüzyon sınırlamaları nedeniyle yapı derinliği, bağlıdır. Yapı yüzeyi, Şekil 4A, yüksek hücre canlılığı görülmektedir. Konfokal mikroskopi, Şekil 4B, daralma, kırmızı ile gösterilen yapı hizalanır yapısı için önemli, miyozin ağır zincir, MHC nedeniyle görülmektedir. Yeşil gösterilen Konneksin 43, miyositler arasında hücresel bağlantı için gerekli. Şekil 1: Genel Bakış sürecinden Şekil 2: A) fibrin jeller oluşturmak için ayrı ayrı ve kombine kalıp parçaları. From soldan sağa: iki teflon contalar, iki silikon o-ringler, Teflon çubuk, bir teflon tüp, tamamlanmış bir malafa mili için, dış gövde ve piston). B) hemen sonra dış gövde (gün 0) ejeksiyon kalıp üzerinde oluşturun. 13 gün sonra kültür kalıp C) Sıkıştırılmış bir yapı (kırmızı ok). Şekil 3: A) kayıt seğirme gücü için Özel daralma kuvvet ölçüm sistemi. Bir yazı ile bir kuvvet dönüştürücü kasılma gücü ölçer ve bir bilgisayara sonuçları verir. Teller ile iki karbon elektrot içeren bir banyo adım inşa elektrik stimülatörü bağlanır. Iki yerde inşa tutun. B) Örnek seğirme gücü dalga formu veri, 0,5 Hz elektrik stimülasyonu ile oluşturulan. Şekil 4: A) 13 gün (ölçek bar = 400 mm) inşa, Live / Dead test. Yeşil, canlı hücreleri temsil eder ve kırmızı ölü hücreleri temsil eder. B) miyozin ağır zincir (kırmızı), Konneksin 43 (yeşil) ve Hoescht nükleer leke (mavi) (ölçek bar = 10 mikron) Konfokal Resim. F çözüm T çözüm Hücre Çözüm Fibrinojen 112 ul Trombin 17 ul DMEM içinde hücreler Ul 170 Hepes 558μl Ca + + Ul 1.3 DMEM 152 ul Toplam 670 ul Toplam Ul 170 Toplam Ul 170 Tablo 1. 1 ml jel Fibrin jel çözümleri, miktarları. Not: 20 mM HEPES Fibrinojen = 33 mg / ml Fibrinojen Tuzlu tamponlu Hepes = 20 mM HEPES tamponlu salin Trombin = 25 U / ml 0.81% NaCl çözeltisi Ca + + = 2 N Kalsiyum Klorür çözüm