في الجسم الحي التصوير المزدوج الركيزة Bioluminescent
Summary
نحن هنا وصف الطرق لبناء والتخيل وقياس ردود الفعل bioluminescent كل من اليراع والإنزيمات وسيفيراز renilla أعرب في خلايا سرطان الثدي النقيلي خلال نموها والانبثاث<em> في الجسم الحي</em>.
Abstract
لدينا فهم كيف ومتى عبور الثدي الخلايا السرطانية من الأورام الأولية التي أنشئت لمواقع المتنقل زاد بمعدل استثنائي منذ ظهور في الجسم الحي bioluminescent 1-3 تقنيات التصوير. والواقع أن القدرة على تحديد مكان وقياس نمو الورم طوليا في فوج واحد من الحيوانات لاستكمال الدراسة في مقابل التضحية الفردية مجموعات من الحيوانات في أوقات محددة قد أحدثت ثورة مقايسة كيفية الباحثين التحقيق الثدي الانبثاث السرطان. للأسف، ومنهجيات التقييم الحالي يحول دون في الوقت الحقيقي من التغييرات الهامة التي ارشح في نظم الخلايا مما يشير كخلايا سرطان الثدي (ط) تتطور داخل الأورام الأولية، (الثاني) نشر في جميع أنحاء الجسم، و (ثالثا) تجديد أعماله البرامج التكاثري في مواقع من النقيلي الآفة. ومع ذلك، التطورات الأخيرة في مجال التصوير bioluminescent جعل من الممكن الآن لتحديد وقت واحد spatiotempor محددةآل التغيرات في التعبير الجيني بوصفها وظيفة من التنمية والتقدم الورم النقيلي من خلال استخدام المزدوج ردود الفعل التلألؤ الركيزة. للقيام بذلك، والباحثين عن الاستفادة الانزيمات الخفيف إنتاج اثنين وسيفيراز معزولة عن اليراع (Photinus البرالس) والبحر وطي (Renilla كلوية الشكل)، وكلاهما الرد على ركائز يستبعد بعضها بعضا التي سهلت في السابق على نطاق واسع الانتشار في استخدام المختبر في الخلية على أساس الجينات مراسل المقايسات 4. نحن هنا تظهر فائدة في الجسم الحي من هذه الانزيمات اثنين من الممثلين أن أحد رد الفعل التلألؤ يمثل على وجه التحديد حجم وموقع الورم النامية، في حين أن التفاعل الثاني الانارة بمثابة وسيلة لتصور حالة تفعيل نظم محددة مما يشير خلال مراحل متميزة من الورم والانبثاث التنمية. وهكذا، فإن أهداف هذه الدراسة هي ذات شقين. أولا، سنقوم بشرح الخطوات اللازمة لبناء الخلية المزدوجة مراسل bioluminescent خطق، وكذلك تلك اللازمة لتسهيل استخدامها في وضع الرؤية والتنظيم الزمانية المكانية في التعبير الجيني خلال خطوات محددة من الشبكة النقيلي. باستخدام نموذج 4T1 ثانوي لورم خبيث من سرطان الثدي، وتبين لنا أن النشاط في الجسم الحي عنصر Smad الاصطناعية تجليد (SBE) انخفض بشكل كبير في المروج الانبثاث الرئة بالمقارنة مع قياس في أن الورم الرئيسي 4-6. في الآونة الأخيرة، وقد تبين الثدي الانبثاث سرطان إلى أن ينظم تغييرات داخل المكروية الورم الرئيسي وسدى رد الفعل، بما في ذلك تلك التي تحدث في الخلايا الليفية والخلايا المناعية تسلل 7-9. وبالتالي، فإن هدفنا الثاني هو للتدليل على فائدة مزدوجة تقنيات bioluminescent في رصد النمو وتوطين السكان من اثنين من خلية فريدة من نوعها داخل آوى حيوان واحد خلال نمو سرطان الثدي وورم خبيث.
Protocol
Discussion
السلطة المطلقة للتقنيات التصوير bioluminescent يكمن في قدرتها على قياس نمو الورم والانبثاث في الدراسات الطولية المعقدة، التي تنطوي على استخدام هذا القانون العدوانية 4T1 خلايا سرطان الثدي. لأن هذه الإجراءات تعتمد على التكامل مستقرة لكلا يبني مراسل وسيفيراز، يمكن تكييفها بسهولة هذه التقنيات وترجم إلى أخرى خطوط الخلايا السرطانية من الورم متفاوتة الإختفاء وقدرات النقيلي. مماثلة لنتائج تظهر هنا، وحساب RLRs محددة داخل تتطور ببطء الأورام الأولية والانبثاث في نهاية المطاف يسمح لتحديد الوقت الحقيقي الزمانية المكانية المحددة من الأحداث يشير إلى أن ارشح خلال التقدم المنتشر من الأورام بغض النظر عن مدتها من الكمون. على تحديد الأحداث المروج محددة التنظيمية، من المهم على حد سواء لاستئصال الورم الرئيسي والآفات النقيلي به لأداء المناعى القياسية وفارقتحليلات ل التعبير الجيني للتحقق من تنظيم مماثل للجين الذاتية و / أو البروتين.
من الناحية الفنية، فإن التحدي الرئيسي للتحليلات bioluminescent المزدوج يكمن في مدة قصيرة نسبيا من إشارات وسيفيراز renilla. على هذا النحو، وهذا يتطلب تقنية التصوير الأمثل كبيرة من حقن الوريد ذيل الإجراء، فضلا عن التصوير الفوري لحقن الحيوانات بشكل فردي، وهي عملية تستغرق وقتا طويلا وغير فعالة إلى حد ما بالنسبة لوسيفيراز اليراع التصوير. مؤخرا، قدم Promega "Viviren"، والتي تمثل الجيل الثاني وسيفيراز الركيزة التي من مواقع الأكسدة يتم حظرها من قبل الأسترة حتى هذا الجزيء في خلايا المكاسب دخول، وعند هذه النقطة هو جزيء بسرعة دي تجمعت. بشكل جماعي، وهذا يخفض بشكل فعال الركيزة رواية التعديل التلقائي التلألؤ وغير محددة و / أو تدهور بالإضافة إلى 12 لصناعة السيارات في التلألؤ renilla التي يسببها. في القيام بذلك، وهذا renill جديدةركيزة وسيفيراز تنتج إشارات أكثر إشراقا الانارة، إلا أن التكاليف المفرطة المرتبطة اقتناء واستخدام "Viviren" لقد قدمت دراسات قليلة نسبيا اللازمة لتقييم فائدة العامة لهذا الركيزة في التحليلات bioluminescent المزدوج. وأخيرا، فإن أي حساسية الفحص bioluminescent يعتمد اعتمادا حاسما على كاميرا CCD فعال في الحصول على وحدات ضوء الفردية. في الواقع، وهذه التقنيات تحسين، ونحن نتوقع مرحلة ما في المستقبل حيث قدرتنا على تصور معقدة ضوء بوساطة التفاعلات bioluminescent قد ارشح بكفاءة في الحيوانات المتحركة مجانا 13.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد WPS في جزء من المنح المقدمة من المعاهد الوطنية للصحة (CA129359)، وسوزان جي كومن للعلاج في مؤسسة (BCTR0706967)، وزارة الدفاع (BC084561)، ومركز السرطان سيدمان، في حين كان مدعوما من قبل MKW الزمالة من الجمعية الأمريكية للسرطان (PF-09-120-01). وقدمت المزيد من الدعم لهذا العمل من قبل مركز للأبحاث القضية التصوير، ومركز حالة الشامل للسرطان (P30 CA43703)، ومركز التليف الكيسي (P30 DK027651).
Materials
| Name of reagent | Company | Catalogue number |
|---|---|---|
| pGL4.2-Puro [luc2/Puro] Vector | Promega | E6751 |
| Glomax Mult-idection system | Promega | |
| IVIS 200 series | Caliper Life Sciences | |
| Dual luciferase reporter Assay system | Promega | E1960 |
| Rediject coelenterazine-h | Caliper Life Sciences | 760506 |
| D-Luciferin K-Salt | Caliper Life Sciences | 122796 |
References
- Wetterwald, A. Optical imaging of cancer metastasis to bone marrow: a mouse model of minimal residual disease. Am. J. Pathol. 160, 1143-1153 (2002).
- Wendt, M. K., Drury, L. J., Vongsa, R. A., Dwinell, M. B. Constitutive CXCL12 Expression Induces Anoikis in Colorectal Carcinoma Cells. Gastroenterology. 135, 508-508 (2008).
- Wendt, M., Schiemann, W. Therapeutic targeting of the focal adhesion complex prevents oncogenic TGF-beta signaling and metastasis. Breast Cancer Research. 11, R68-R68 (2009).
- Korpal, M. Imaging transforming growth factor-beta signaling dynamics and therapeutic response in breast cancer bone metastasis. Nat Med. , (2009).
- Giampieri, S. Localized and reversible TGFbeta signalling switches breast cancer cells from cohesive to single cell motility. Nat Cell Biol. 11, 1287-1296 (2009).
- Giampieri, S., Pinner, S., Sahai, E. Intravital imaging illuminates transforming growth factor beta signaling switches during metastasis. Cancer Res. 70, 3435-3439 (2010).
- DeNardo, D. G. CD4(+) T cells regulate pulmonary metastasis of mammary carcinomas by enhancing protumor properties of macrophages. Cancer Cell. 16, 91-102 (2009).
- Wyckoff, J. A Paracrine Loop between Tumor Cells and Macrophages Is Required for Tumor Cell Migration in Mammary Tumors. Cancer Res. 64, 7022-7029 (2004).
- Kim, M. Y. Tumor self-seeding by circulating cancer cells. Cell. 139, 1315-1326 (2009).
- Aslakson, C. J., Miller, F. R. Selective events in the metastatic process defined by analysis of the sequential dissemination of subpopulations of a mouse mammary tumor. Cancer Res. 52, 1399-1405 (1992).
- Wendt, M. K., Smith, J. A., Schiemann, W. P. Transforming growth factor-beta-induced epithelial-mesenchymal transition facilitates epidermal growth factor-dependent breast cancer progression. Oncogene. 29, 6485-6498 (2010).
- Hawkins, E., Unch, J., Murhpy, N., Vidugiriene, J., Scurria, M., Klaubert, D., Wood, K. Bright Light, No Lysis. Measuring Renilla Luciferase Luminescence in Living Cells. , (2005).
- Roncali, E. New device for real-time bioluminescence imaging in moving rodents. J. Biomed. Opt. 13, 054035-054035 (2008).
