במצע כפולה vivo bioluminescent ההדמיה

1. ביטוי יציב של לוציפראז Renilla CMV-Driven Transfection ובחירה של אוכלוסייה משובטת יציבה הוא השיטה המועדפת לביטוי של עיתונאי לוציפראז renilla זה. גישה זו מניבה ביטוי לוציפראז renilla עקבי ואחיד יותר בעקבות הכניסה הבאה של מבנים משניים נוספים כתב (למשל, הגחלילית לוציפראז או חלבוני ניאון). Transfect תאים ממאירים עניין עם בלוציפראז renilla קידוד וקטור הביטוי, כגון pcDNA3.1-Hygro או אחר פלסמיד מחסה סמן בחירה. בעקבות transfection, למקם את transfectants תחת ריכוז אנטיביוטיקה מותאם למספר ימים-to-שבועות כדי להקל על הבידוד של מושבות בודדות, אשר בודדו בהמשך בנפרד וsubcultured. בחר ≥ 10 מושבות renilla בודדות לוציפראז מבטא-לפקח על מידת ביטוי renilla. <liמושבות> מבטאות כמויות גבוהות של לוציפראז renilla חשופות להמשך תפקודי מנתח כדי להבטיח ש( i) את מאפייני pathophysiological של עמיתי הוריהם נשמרים, וכן (ii) ערכי הביטוי renilla אינם חורג או השינוי לאורך זמן. פעולות אלה הן חיוניים כדי למנוע בידוד ולומד גרסות / סוטים משובטות, וכדי לאמת את שילוב נכון של מבנה renilla לתוך הגנום. ברגע transfectant יציב מבודד ואומת, אפשר להסיר את לחץ הברירה ולהיות סמוכים ובטוח כי הביטוי של לוציפראז renilla יישאר קבוע לאורך אורכי זמן ממושכים במבחנת in vivo. 2. ביטוי, בחירה ואימות פונקציונלית של מושרה Firefly לוציפראז יזם-Driven Subclone האמרגן של עניין לכתב pGL4-לוציפראז פלסמיד מחסה סמן לבחירה (למשל, פורomycin) שהוא שונה מזו משמשת לבחירה לביטוי renilla יציב (למשל, hygromycin). Transfect תאים ממאירים כמו בשלב הראשון, ולאחר מכן בחר לאוכלוסיית polyclonal יציבה של תאי הגחלילית לוציפראז מבטאים-. בגלל המיקום שבו גן הדו"ח משתלב בגנום יכול לעורר תופעות שגויות בביטוי והרגולציה שלה, מומלץ מאוד לבחור עבור אוכלוסיות polyclonal של תאי הגחלילית לוציפראז מבטאים-בניגוד לאוכלוסיות משובטות כדי להבטיח שביטוי גן הכתב (אני) יותר משקף במדויק ששל גן אנדוגני בתאים הוריים, וכן (ii) השפעות אינטגרציה על ביטוי גנים הן ממוצעים ופחתו על פני אוכלוסיית התאים הטרוגנית. תאים ממאירים מהונדסים יציבות לבטא גם luciferases הגחלילית renilla והם מתייחסים אליהם כתאים כפולים bioluminescent כתב, או תאי DBR. שימוש <מסורתיem> במבחני חוץ גופייה מבוססי תאים וציפראז כתב גנים, ודא כי תאי DBR לווסת ביטוי בלוציפראז גחלילית, או חיובי או שלילי, באופן concordant עם זה שנצפה בתאי transfected הורים זמנית עם הווקטורים האלה. כמו כן, ודא שביטוי CMV מונחה של renilla אינו מוסדר על ידי גירויי תאים שונים או בתנאי טיפול. כדי לעשות זאת, התרבות DBR ותאים הוריים בצלחות 24 גם, ולאחר מכן transiently שיתוף transfect תאים הוריים עם CMV-renilla המקורי ואמרגן-גחלילית בונה משמש ליצירת תאי DBR. לאחר מכן, טיפול DBR ותאי הורי transfected עם גורמים או סוכנים תרופתיים ידועים להסדיר את האמרגן של עניין, ולאחר מכן לכמת גחלילית והארת renilla באמצעות ערכת Assay לוציפראז Promega הכפולה. 3. הקמת 4T1 גידולי חלב ראשוניים תאי קרצינומה גרורתי 4T1 חלב שאנומחדש מצא לפתוגנים מכרסמים adventitial חוסר הונדסו ביציבות להביע לוציפראז CMV מונע renilla (pcDNA3.1-CMV-renilla לוציפראז-hygro) וגחלילית לוציפראז SBE מונחה (pGL4.2-SBE-גחלילית לוציפראז-Puro) כ שתואר לעיל. engraftment orthotopic של תוצאות אלו תאי סרטן השד בהיווצרות ספונטניות של גרורות בעיקר לריאות. תאי 4T1 אסור להגיע לנקודת מפגש בהתפשטותם במערכות תרבות מסורתיות 2-ממדי רקמות, והם צריכים להיות passaged היום לפניהם בחיסון גוף חי. תאי 4T1 צריכים להיות מנותקים על ידי trypsinization, שטף ביסודיות בתקשורת צמיחה, ודילול בPBS לריכוז של 2×10 5 תאים / מ"ל ומאוחסנים באופן מיידי על קרח. נקבות עכברי BALB / C (4-6 שבועות) צריכים להיות מורדמים עם מינון אינדוקציה של 3% isoflurane ונשמר תחת הרדמה במינון של 1% isoflurane. הכן את אתר ההזרקה על ידי ניגוב עם70% אלכוהול רפואי. השימוש במלקחיים, בעדינות לתפוס ולהרים את כרית החלב מפשעתי 4. זהירות, הנח צד פוע מחט מד 27.5 ולהזריק לתוך כרית שומן החלב ישירות מתחת לפטמה, טיפול מיוחד לא לדחוף את המחט לתוך חלל הבטן. שחרר את הבלוטה ולהזריק 50 μl של השעית התא (1×10 4 תאים) לאט לתוך כרית שומן החלב. 4. הדמיה ראשונית כפולה זריח מייד לאחר engrafting תאי 4T1 על כרית שומן החלב ואילו עכברים הם עדיין מורדמים, להזרים 100 μl של Coelenterazine RediJect לתוך וריד הזנב לרוחב. זהו ריכוז המצע האופטימלי מומלצים על ידי היצרן והטוב ביותר הנסבל על ידי בעלי החיים. מייד למקם את העכבר לחרטום isoflurane בתוך מערכת הדמית IVIS-200 ולרכוש תמונה זורחת 0.5-1 דקות. יעילות בין הזרקה ורכישה של תמונה היא חשובה מאוד, כאותללוציפראז renilla יורד בתלילות ~ 30 שניות לאחר ההזרקה. הנח את העכבר בחזרה לכלוב שלו ולאפשר לו להתאושש ל≥ 1 שעה, מה שמבטיח שכל אות לוציפראז renilla שיורים התפוגגה ושהעכבר התאושש לגמרי מההרדמה. לנהל 150 מ"ג / ק"ג של מלח אשלגן D-luciferin באמצעות הזרקת IP ולהמתין 5 דקות. זהו הריכוז האופטימלי של D-luciferin, המספק אות זורחת יציבה במשך 5-15 דקות לאחר החדרתו לבעלי חיים. הרדם את העכבר באמצעות isoflourane ולהחליף בIVIS-200, בטיפול כדי למקם את החיה במיקום יחסי לרכישת renilla המקורית דומה מאוד. העצמה הכוללת של אות גחלילית זה תהיה תלוי בפעילות של האמרגן של עניין, ו, פעילות לוציפראז כדוגמת המחשת גחלילית עשויה לדרוש פעמי רכישה מורחבות. שימוש בתוכנת תמונת חי IVIS המוגדרת למצב "פוטונים", להקים values עבור רכישות גחלילית כאמצעי לבסס יחסי הארה יחסיים בסיסיים (RLR) renilla ו. 5. אורך זריח הדמיה תאי 4T1 הם אגרסיביים מאוד, כך שהחיסון של 1×10 4 תאים בדרך כלל מוביל להיווצרות גידול מוחשית בתוך השבוע 1, והקטלניות של החיה בתוך 4-5 שבועות. גידולי 4T1 יש כיב נטייה טבועה בשבוע 4. הצמיחה והתחזוקה של גידולי כיבים עשויות לדרוש אישור IACUC נפרד. מחקרי הגידול 4T1 מוצגים במסמך זה אושרו על ידי IACUC באוניברסיטת Case Western Reserve. כפי שתואר לעיל, עכברים צריכים להיות מוזרקים שבועיים עם Coelenterazine RediJect לפקח צמיחת גידול כללית וגרורות, וכן עם D-luciferin לפקח איתות מסלול ספציפי במהלך שלבים שונים של התפתחות גידול. היזהר בכל פעם על מנת להבטיח את אות לוציפראז renilla התפוגגה לחלוטין לפני הרכישהשל אות בלוציפראז הגחלילית. כגידולי 4T1 להתפתח ולהתקדם, רכישות וציפראז renilla צריכות להיות מנורמלות לערכי renilla הראשוניים שנמדדו בעת הדבקת תאי גידול כאמצעי לנורמליזציה ולעקוב אחר צמיחת גידול ראשונית. וחשוב יותר, חישוב ערכי RLR לאורך הזמן יקים רגולציה הזמנית של מערכות איתות בודדות יחסית לצמיחה והתקדמות גידול. גרורות ריאה גלויות מתבררות בתוך 3-4 שבועות לאחר engraftment התא 4T1 על כרית שומן החלב. השוואת ערכי RLR ריאות לעומת אלו שמחושבים לגידול הראשוני קובעת תקנה המרחבי של מערכות איתות בודדות יחסית לגידול וגרור. 6. הדמית bioluminescent כפולה של שני סוגי תאים ייחודיים בבעלי חיים יחידים קו אחד מהנדס סרטן שד לתא לוציפראז יציבות הביטוי CMV מונע renilla כפי שתואר לעיל. חזור על פעולה זותהליך הנדסי באמצעות בלוציפראז הגחלילית CMV מונחה על קו שני ברור סרטן שד תא. מסמך זה אנו מעורבים renilla לוציפראז-להביע תאי 4T1 עם עמיתיהם nonmetastatic וisogenic גחלילית לוציפראז מבטאים-4T07 10, 11. יחסים משתנים של אוכלוסיות אלו מעורבות בסרטן שד תאים מוזרקים לאחר מכן לתוך כרית שומן החלב כמתואר לעיל. מייד לרכוש גם גחלילית ותמונות וציפראז renilla להקים נציג RLRs ראשוני של תערובת תא נתון מחוסנת. הדמית bioluminescent כפולה אורך תהיה לחזות ולעקוב אחר שינויים בהרכב התאי בתוך הגידול הראשוני, כמו גם את גרורת החלל ובזמן של כל נגזרת סרטן שד בהשוואה לצמיחת גידול ולהתפתחותו. לחלופין, אוכלוסיות תאי סרטן השד בודדות יכולות להיות מחוסנות למקומות שונים בעכבר (כלומר רפידות בטן חלב ימניות ושמאליות שומן)כדי להעריך את ההשפעות המערכתיות שתי אוכלוסיות אלה תערוכה על אחד אחר במהלך שלבים שונים של צמיחת גידול וגרור. 7. נציג תוצאות: כוח עיקרי של הדמית bioluminescent כפולה טמון בעובדה שכל תמונה היא פנימי עקבית ומבוקרת, כך שהאותות המתמשכים הנגזרים מגידול הראשונית הפונקציה כמדד חשוב כדי לאמוד הצלחה או הכישלון הכוללת של כל renilla ורכישת גחלילית. היבט זה של הליך ההדמיה חשוב במיוחד במהלך רכישות של פעילות renilla לוציפראז, Coelenterazine שמצע הוא רגיש מאוד לחמצון כי תוצאות ביכולתה האוטומטית הארה. האיור 1 א מציג דוגמה לאפקט זה צד, שבא לידי ביטוי באופן מיידי כאותות זורחים לא ספציפיים הנגזרים ממערכת העיכול, ולא גידול הראשוני והמבוסס. בדרך כלל, אלה Coelenterazine הספציפי מאותת transpirלהלן דואר נכשל זריקות תוך ורידים של מצע לוציפראז renilla זה. עם זאת, ברגע שאותות עיקריים המופקים מגידול חזקים renilla הושגו (התרשים 1B, תמונה משמאל), זה בטוח להמשיך בלכידת מדידות מסלול איתות ספציפיות הנגזרות מהדמית הגחלילית לוציפראז (1B איור, לוח ימני), שD-luciferin מצע הוא מאוד יציב על הזרקת IP ומייצר רמות זניחות של הארה אוטומטית ברקע. איור 1. רכישת renilla וגחלילית-נגזר תמונות bioluminescent לחשב בRLRs vivo. () דוגמה להזרקה נכשלה IV של Coelenterazine כתוצאה אות ספציפית ממערכת העיכול. המעגל וPT מצביעים על המיקום המשוער של הגידול הראשוני. (ב ') רכישת renilla מוצלחת של עכבר נושאה גידול ראשוני 4T1 ו-pגרורות ulmonary (פנל שמאלי; 4wk לאחר engraftment כרית שומן). רכישת הגחלילית המקבילה מאפשרת חישוב RLRs הן מהגידול הראשוני והגרורות ריאתיות. (ג) ייצוג גרפי של גידול הראשוני והגרור RLRs ריאתי מחושב מעכברים המוצגים בלוח ב '(n = 4).