Криоконсервация эмбрионов мыши на этиленгликоля основе Витрификация

Общая схема эксперимента приведена на рис. 1. 1. Подготовка реагентов Сделать базу среде (здесь в известный как PB1) в 100 мл стеклянную бутылку в соответствии со следующей таблице ниже: МВт мМ мг/100мл NaCl 58,4 136,98 800,0 KCl 74,6 2,68 20,0 KH 2 PO 4 136,1 1,47 20,0 Na 2 HPO 4 0,12 H 2 O 358,14 8,04 288,1 MgCl 2, 6H 2 O 203,3 0,49 10,0 <tг> Глюкоза 180,2 5,56 100,0 Na пирувата 110 0,33 3,6 CaCl 2 2H 2 O 147 0,9 13,2 Пенициллин G 6.0 (приблизительно) Сделать Ficoll-сахарозы (FS) решение: Добавить следующие химические вещества до 14 мл PB1 решение в 50 мл трубки. Ficoll 70 6,0 г Сахароза 3,424 г BSA 42,0 мг Смешайте Ficoll 70 и сахарозы в PB1 решения и взболтать до полного растворения. После проверки полного растворения выше, добавить BSA на поверхности раствора и держать его на4 ° С до BSA полностью растворяется (> 4 часа или на ночь). Сделать уравновешивания раствора (EFS20) и стеклования решение (EFS40) в 50 мл трубки: EFS20: 20% (объем / объем) этиленгликоль, 24% (вес / объем) Ficoll и 0,4 моль / л сахарозы в PB1 с BSA EFS40: 40% (объем / объем) этиленгликоль, 18% (вес / объем) Ficoll и 0,3 моль / л * сахарозы в PB1 с BSA * Для получения эмбрионов из штамма BALB / с или ICR, повышают концентрацию сахарозы до 0,9 моль / л сахарозы, потому что они более чувствительны к криоповреждения 6. EFS20 решение EFS40 решение Этиленгликоль 1 мл 2 мл FS решение 4 мл 3 мл Стерилизовать раствор фильтрации с использованием 0,45 мкм filteг. Сделать аликвоты в 5 мл пробирки полистирола и хранить при 4 ° C. Они могут быть использованы в течение 6 месяцев. Подготовка эмбриона оттаивания раствора, содержащего 0,75 М сахарозы (TS1) Растворите 7,7 г сахарозы в PB1 (подготовлен в шаге 1.1) и довести общий объем до 30 мл. Смешать, осторожно встряхивая, пока сахарозы полностью не растворится. Добавить 90 мг BSA на поверхность раствором и оставьте стоять до полного растворения. Стерилизовать раствор путем фильтрации. Алиготе и хранить при температуре 4 ° C. Они могут быть использованы в течение 1 месяца. Примечание: TS1 также могут быть получены из имеющихся в продаже М2. Растворите 7,7 г сахарозы в М2 и довести общий объем до 30 мл. Смешать, осторожно встряхивая, пока сахарозы полностью не растворится. Стерилизовать раствор путем фильтрации. Алиготе и хранить при температуре 4 °. Они могут быть использованы в течение 1 месяца. TS2 (оттаивания решениесодержащем 0,25 М сахароза): Развести 10 мл TS1 с 20 мл объема PB1 или M2, по мере необходимости. Алиготе и хранить при температуре 4 ° C. Они могут быть использованы в течение 1 месяца. 2. Остекловывание 2-клетки эмбрионов мыши Подготовка 2-клетка эмбриона мыши, естественного спаривания или обычный в технике искусственного оплодотворения. Алиготе 50 мкл EFS40 в криоскопической пробирки. Здесь и далее выполнять остальные стеклования процедуру при комнатной температуре. Алиготе 50 мкл EFS20 в нижней части 35 мм или 60 мм пластиковые чашки Петри. Трансфер до 30 эмбрионов EFS20 использованием стеклянный капилляр только с минимальным количеством питательной среды. Начало таймер на 2 мин. Примечание: Место эмбрионов в нижней части капли. Это делает эффективным обезвоживание эмбрионов. Проверьте морфология эмбрионов путем стереомикроскопа. Обезвоженная эмбрионов показать сморщенные морфологии, как показано на рис. 2А.Если они не будут достаточно обезвоженная, ждать больше 1 или 2 мин. Примерно в 1,5 мин, забрать эмбрионов из EFS20 падение только с минимальным количеством раствора. Передача их в EFS40 криоскопической пробирки подготовлен в шаге 2.1. Примечание: Для достижения наилучших результатов, корректировать сроки подбирая эмбрионы так, что все эмбрионы могут быть перенесены в EFS40 около 2 мин. Подождите 1 мин. Положите криоскопической пробирки непосредственно в жидкий азот (LN 2). 3. Размораживание керамические 2-клетки эмбрионов мыши Перед оттаиванием, готовить блюда по 10 мкл капли эмбриона питательной среды для восстановленных эмбрионов (см. шаг 3.13). Обложка блюдо с маслом и поставить в CO 2 инкубаторе до использования. Примечание: Несмотря на любых носителях для рутинных культуры эмбриона могут быть использованы в этом опыте, мы рекомендуем средства массовой информации с более высокой осмолярности, такие как средний М16. Теплый TS1 до 37 ° C. Наденьте маску и cryogloves. Открытое Л. Н. 2 тАНК и извлекать криоскопической пробирки содержащие эмбрионов. Быстро открывает верхней части трубки и отбросить LN 2. Подождите 30 секунд, чтобы предотвратить TS1 от замерзания на следующий шаг. Используйте 1000ul пипетки добавить 850 мкл TS1 (37 ° С) в трубку и перемешать раствор, осторожно pipettings (примерно в десять раз в 25 секунд), пока раствор равномерно растворились. Передача весь объем трубки 60 мм пластиковые чашки Петри (или часовое стекло) (рис. 3А). Примечание: Эмбрионы должны обрабатываться при комнатной температуре (22-25 ° С), пока они не помещаются в CO 2 инкубаторе на шаге 3.14. Начало таймер на 3 мин. Около 2 мин в TS1, встряхните блюдо, пока среда, содержащая эмбрионы распространяется на поверхности чашки (рис. 3В). Примечание: Это поможет эмбрионов спуститься на дно, потому что они плавают у поверхности при передаче на TS1. Положите три 50 мкл капли TS2 на гоэлектронной блюдо (рис. 3в). Через 3 минуты в TS1, проверьте морфология эмбрионов путем стереомикроскопа, они должны быть слегка сморщенным. Смотрите морфология эмбрионов в предыдущих (рис. 2В) и выше (рис. 2) в TS1. Примечание: Если эмбрионов до сих пор опухший, держать их в TS1 более 1 до 3 мин. Возьмите эмбрионов и передавать их в первую каплю TS2 (рис. 3D). Начало таймер на 3 мин Через 3 минуты, передачи эмбрионов второго падения, а затем в третьем раскрывающемся (рис. 3Е). Трансфер эмбрионов к культуральной среде подготовлена ​​на шаге 3.1. Эмбрионы в форму, показанную на рис. 2D. Место блюдо в CO 2 инкубаторе. Около 10 минут спустя, передача эмбрионов на следующий капли культуральной среде, чтобы смыть сахарозы, которая была перенесена из TS2. Продолжить культуры в CO2-инкубаторе до переноса эмбрионов. Примечание: Передача ЭмбриОС яйцеводы получателя самок на день оттаивания. Длинные культуры в пробирке может уменьшиться жизнеспособность эмбрионов в некоторых линий мышей. 4. Представитель Результаты: В пробирке – и в естественных условиях развития эмбрионов после оттаивания представлены в таблицах 1 и 2. Преимущества этого протокола высокой живучести эмбрионов после оттаивания и его широкое применение в различных штаммов мышей. Напряжение Общее количество труб Количество эмбрионов керамической Восстановленные (№ (%)) Морфологически нормальные (№ (%)) Развитию бластоцист (№ (%)) C57BL/6J 20 400 397 (99) 394 (99) 342 (87) BALB / сА 15 300 296 (99) 282 (95) 238 (84) ICR 24 480 474 (99) 443 (93) 398 (90) Таблица 1. Экстракорпоральное развития керамических-размороженные эмбрионы в общих линий мышей Состояние эмбрионов Количество получателей женщин Количество эмбрионов Имплантация сайтов (№ (%)) Живая потомства (№ (%)) Свежий 12 180 141 (78.3) 110 (61.1) Керамические 16 242 202 (83.5) 125 (51.7) Таблица 2. В естественных условиях развития керамических-размороженные эмбрионы мышей C57BL/6J. Рисунок 1. Общая схема эксперимента в том числе равновесия, стеклование, и оттаивания эмбрионов. Рисунок 2. Морфологии эмбрионов на каждом этапе размораживания. Рисунок 3. Размораживание процедуры эмбрионы. Все процедуры проводятся при комнатной температуре. (А), добавить 850 мкл TS1 (37 ° С) в криоскопической пробирки и передача всего объема раствора в криоскопической пробирки на пластиковую тарелку. В это время эмбрионы выглядят опухшими, как показано на рис. 2B. (B), Spread решение по поверхности блюдо, осторожно встряхивая. (C), место три 50 мкл капли TS2 на пластиковые тарелки. (D), трансфер эмбрионов первой капли TS2. Через 3 минуты, эмбрионы выглядят shurunken, как показано на рис. 2C. (E), передачи их серийногоLy в оставшиеся TS2 капель, а затем в культуральной среде.