エチレングリコール系ガラス化によるマウス胚の凍結保存

実験の全体的なスキームを図に示します。 1。 1。試薬の調製以下の表に応じて100mlのガラス瓶に、基本培地を（ここでPB1とも呼ばれる）を確認します。 MW mMの mg/100ml NaClを 58.4 136.98 800.0 塩化カリウム 74.6 2.68 20.0 KH 2 PO 4 136.1 1.47 20.0 のNa 2 HPO 4 0.12 H 2 O 358.14 8.04 288.1 のMgCl 2 · 6H 2 O 203.3 0.49 10.0 <tD>グルコース 180.2 5.56 100.0 Naのピルビン酸 110 0.33 3.6 のCaCl 2、2H 2 O 147 0.9 13.2 ペニシリンG 6.0（約） フィコール – スクロース（FS）ソリューションを作成します。 50 mlチューブにPB1ソリューション14mlのために、以下の化学物質を追加。 フィコール70 6.0グラムスクロース 3.424グラム BSA 42.0ミリグラムフィコール70およびPB1溶液中でのショ糖を混ぜて、完全に溶解するまでよく振る。 上記の完全な溶解を確認した後、溶液の表面にBSAを追加し、それを根気よく続けるBSAするまで4℃で完全に（> 4時間または一晩）に溶解する。 50 mlチューブで平衡化溶液（EFS20）とガラス化液（EFS40）を行います。 EFS20：20％（v / v）のエチレングリコール、24％（w / v）のフィコール、とBSAとPB1の0.4モル/ Lのスクロース EFS40：40％（v / v）のエチレングリコール、18％（w / v）のフィコール、とBSAとPB1の0.3モル/ L *スクロース彼らは6 cryodamageに敏感なので、* BALB / cまたはICR系統の胚は、0.9モル/ Lショ糖にショ糖の濃度を増加させる。 EFS20ソリューション EFS40ソリューション エチレングリコール 1ミリリットル 2ミリリットル FSのソリューション 4ミリリットル 3ミリリットル 0.45μmのfilteを使用してろ過により溶液を滅菌R. 4℃で5ミリリットルポリスチレンチューブとストア内のアリコートを作る℃に彼らは約6ヶ月間使用することができます。 0.75 Mスクロース（TS1）を含む胚融解液の調製 PB1のショ糖（ステップ1.1で調製したもの）の7.7 gを溶かし、30 mlに、総容積をもたらす。ショ糖が完全に溶解するまで穏やかに振盪して混合します。 表面上に溶液をBSAの90 mgを追加し、完全に溶解するまでそれはスタンドのまま。 ろ過により溶液を滅菌する。 4℃で分注し店彼らは約1ヶ月間使用することができます。 注：TS1はまた市販のM2から調製することができます。 M2のショ糖の7.7 gを溶かし、30 mlに、総容積をもたらす。 ショ糖が完全に溶解するまで穏やかに振盪して混合します。 ろ過により溶液を滅菌する。 4℃で分注し店。彼らは約1ヶ月間使用することができます。 TS2（解凍ソリューション：0.25 Mショ糖）を含む必要に応じて、PB1またはM2の20mlの量で10ml TS1を希釈する。 4℃で分注し店彼らは約1ヶ月間使用することができます。 2。 2セルのマウス胚のガラス化 体外受精の技術で自然交配あるいは従来で2細胞マウス胚を準備します。 クライオチューブに分注し50μlのEFS40を。以後、常温でガラス化の手順の残りを実行します。 35ミリメートル以上60ミリメートルのプラスチックペトリ皿の底にEFS20物のアリコートを50μl。 培地のみの最小限の量でガラスキャピラリーを使用してEFS20に30胚まで転送する。 2分間タイマーを開始します。 注：ドロップの底の上に置いて胚。これは、胚の効率的な脱水を行います。実体顕微鏡による胚の形態を確認してください。 図に示すように脱水胚は、縮小形態を示す。 2A。彼らは十分に脱水されていない場合は、1以上または2分間待つ。 約1.5分で、ソリューションののみ最小限のEFS20ドロップから胚を拾う。ステップ2.1で作成したクライオチューブにEFS40にそれらを転送する。注：最良の結果を得るためには、全ての胚が約2分間でEFS40に転送できるように、胚を拾うのタイミングを調整する。 1分間待ちます。 液体窒素（LN 2）に直接クライオチューブを置く。 3。ビトリファイド2セルのマウス胚を融解解凍する前に、回収された胚の胚培養の培地10μlの滴（ステップ3.13を参照）で料理を準備。使用するまでCO 2インキュベーター内でオイルと場所との皿に蓋をする。注：ルーチン胚培養のためのあらゆるメディアがこの実験で使用されるかもしれませんが、我々はそのようなM16媒体として高い浸透圧でメディアをお勧めします。 37℃にTS1を温めるフェイスマスクとcryoglovesに置く。 LN 2 tを開きます。ANKと胚を含むクライオチューブを取り出す。 すぐにチューブの上部を開き、LN 2を捨てる。次のステップで凍結からTS1を防ぐために30秒間待ちます。 チューブにTS1（37℃）850μlを加え、溶液が均一に溶解するまで穏やかpipettings（25秒で約10倍）で溶液を混合する1000ulピペットを使用してください。 プラスチック製の60ミリメートルペトリ皿（または時計皿）（ 図3A）にチューブのボリューム全体を転送する。注：彼らはステップ3.14でCO 2インキュベーター内に配置されるまで胚を室温（22〜25℃）で処理する必要があります。 3分間タイマーを開始します。 胚を含む培地をシャーレの表面（ 図3B）に分散されるまで、TS1で約2分で、ゆっくりと料理を振る。注：これはTS1に転送するときに彼らは表面近くに浮遊しているので、胚が一番下まで行くのに役立つ。 目の上にTS2の三​​50μlの滴を入れてE皿（ 図3C）。 TS1の3分後、実体顕微鏡による胚の形態を確認して、彼らは少し縮んだすべきである。 TS1で以前の胚の形態（ 図2B）を参照して 、後で（ 図2C）。注：胚がまだ腫れている場合は、3分〜1詳しくは、TS1に保管してください。 胚を拾うとTS2の最初のドロップ（ 図3D）に移す。 3分間タイマーを起動します。 3分後、3番目のドロップ（ 図3E）に2番目のドロップに胚を移すと。 ステップ3.1で調製した培地に胚を移す。胚は、 図に示すような形状になります。 2D。 CO 2インキュベーター内での場所の皿。約10分後、TS2から引き継がれているショ糖を洗い流すための培地の横にあるドロップに胚を移す。 胚移植まで、CO2インキュベーターで培養を継続。 注：転送ブリー解凍の日に受取人の女性の卵管にOS。 in vitroでの長い文化は、マウスの一部の菌株における胚の生存率が低下する場合があります。 4。代表的な結果： 解凍は、表1と表2に示されており、胚の in vivo開発の後で- in vitroで 。このプロトコルの利点は、マウスの異なる系統に解凍し、その広範な適用後の胚の高い生存性があります。 ひずみチューブの合計数ガラス化胚の数 （番号（％））を回収形態的に正常（第（％）） 胚盤胞への開発（第（％）） C57BL/6J 20 400 397（99） 394（99） 342（87） BALB / cAの 15 300 296（99） 282（95） 238（84） ICR 24 480 474（99） 443（93） 398（90） 表1。一般的なマウス系統におけるガラス化融解胚の体外開発で 胚の状態受信者女性の数転送された胚の数着床部位（番号（％）） 子孫を生きる（第（％）） 新鮮な 12 180 141（78.3） 110（61.1） ガラス固化 16 242 202（83.5） 125（51.7） 表2。C57BL/6Jマウスにおけるガラス化融解後の胚のin vivoで開発中 。 図1。胚の平衡化、ガラス化、融解を含む実験の全体的なスキーム。 図2凍結融解の各段階で胚の形態。 図3。胚の手順を解凍。すべての手順は室温で実施されています。 （）、クライオチューブにTS1（37℃）850μlを加え、プラスチック製の皿にクライオチューブ内の溶液のボリューム全体を転送する。この時点では、胚は、 図1のように腫れて見える。 2B。 （B）、軽く揺することで皿の表面上にソリューションを広げる。 （C）、プラスチック製の皿にTS2の三​​50μlの滴を入れます。 （D）、TS2の最初のドロップに胚を移す。 図に示すように3分後、胚はshurunken見える。 2C。 （E）、それらをシリアル転送残りのTS2の滴にし、培養培地にLY。