FM Boyalar Kültür Serebellar Granül Nöronlar Synaptic veziküllü Havuzu Yenileme Kantitatif Analiz
Summary
Merkezi sinir terminallerine ikmal ve belirli sinaptik vezikül (SV) havuzları seferberlik ölçmek için canlı bir floresan görüntüleme tekniği açıklanmıştır. SV geri dönüşüm iki tur bir iç kontrol sağlayan aynı sinir uçlarında izlenir.
Abstract
Merkezi sinir uçlarında nörotransmitter yayımlanmasından sonra, SV hızla endositoz alınır. Sonra alındı. SV nörotransmitter ile doldurulabilir ve ekzositoz 1,2 SV olarak tanımlanan, geri dönüşüm havuzu, geri dönmek. Kolayca açıklanmaması havuzu (RRP) ve rezerv havuzu (RP) – geri dönüşüm havuz, genellikle iki ayrı havuza ayrılmıştır. Isimlerinin ima ettiğin gibi, RRP RP SV yoğun stimülasyonu 1,2 sırasında yayımlanan hemen füzyon için kullanılabilir olduğunu SV oluşur. 1) anlamak için bu SV havuzları diferansiyel ikmal raporlar güvenilir bir tahlil olması önemlidir. SV endositoz farklı modlar sonra trafik (clathrin bağımlı endositoz ve aktivite bağımlı toplu endositoz) ve 2) mekanizmalarının nasıl RRP ve RP hem de farklı uyaranlara tepki olarak seferber kontrol.
FM boyalar rutin olarak kullanır.ed kantitatif merkezi sinir terminallerine 3-8 SV ciro rapor etmek. Membranlar boyunca çift katlı lipid geri dönüşümlü bölümleme sağlar hidrofobik hidrokarbon kuyruk ve hidrofilik bir başı grup engelleyen geçit var. Boyalar, biraz sulu çözeltisi floresan, ancak membran 9 bölümlenmiş kuantum verimi önemli ölçüde artırır . Böylece FM boyalar aktif SV geri dönüşüm izleme için ideal bir floresan probları. FM boya kullanımı için standart bir protokoldür. Önce nöronlar uygulanır (Şekil 1) endositoz sırasında alınır. Olmayan içselleştirilmiş boya geri dönüşüm havuz içinde plazma membranı, geri dönüşümlü SV yeniden dağıtma yıkanıp sonra. Bu SV sonra boşaltma uyaranlara (Şekil 1) kullanarak tükenmiş. SV FM boya etiketleme quantal 10 olduğundan, ortaya çıkan floresans damla piyasaya veziküller miktarı ile doğru orantılıdır. Böylece, SV, geri dönüşüm ve füzyon pr eldeendositoz evious yuvarlak güvenilir bir şekilde belirlenebilir.
Burada, iki ek bilgi unsurları elde etmek için modifiye edilmiş bir protokol mevcut. Öncelikle, sıralı boşaltma uyaranlara farklı ölçümü belirli SV havuzları ikmal izin vermek için RRP ve RP boşaltmak için kullanılır. İkincisi, her sinir terminal protokolü iki defa uğrar. Böylece, bir iç kontrol sağlayan, aynı sinir terminal S1 yanıt S2 faz (Şekil 2) bir test maddenin varlığına karşı karşılaştırılabilir. SV geri dönüşüm farklı sinir uçları arasında 11 dereceye kadar oldukça değişken olduğundan bu önemlidir.
Herhangi yapışık birincil nöronal kültürlerin bu protokol için kullanılan olabilir, ancak kaplama yoğunluğu, çözümleri ve stimülasyon şartları, serebellar granül nöronların (CGNs) 12,13 için optimize edilmiştir .
Protocol
Discussion
FM boyalar yoğun birçok nöronal hazırlıkları sinir terminali fonksiyon araştırmak için kullanılır. Onlar ya SV endositoz, SV ciro veya ekzositoz 6 kinetiği ölçüde izlemek başta olmak üzere istihdam edilmiştir. Açıklanan protokol belirli SV havuzlarının boşaltılması diferansiyel incelemek için bu çalışmalar uzanır. Bu SV havuzlarının yenileme ve aynı zamanda seferberlik ölçüde ilgili ek bilgi sağlar.
FM boyalar aynı sinir terminalleri içinde SV geri dönüşüm birden fazla mermi etiket kullanılabilir. Biz her bir terminal SV ciro aynı sinir uçlarında iki kez takip edilebilir olan protokoller bu özelliği istismar ve tasarladık. Bu paralel sinir terminallerine 11 SV geri dönüşüm heterojen doğası nedeniyle gerekli, doğru bir iç kontrol sağlar. S1 faz bir iç kontrol sistemi olarak kullanımı, Via RRP, RP ve toplam dolumSV pool ilaçların varlığı güvenilir ve doğrudan mukayese edilebilir.
RRP ve RP havuzları, geri dönüşüm mutlak büyüklüğü bilgi vermenin yanı sıra, farklı stimülasyon koşullar altında, bu protokol, ayrıca şunları da veri sağlayabilir – 1) geri dönüşüm havuz bir fonksiyonu olarak RRP ve RP arasında SV, bölümleme S1 ve S2, 2) toplam S1 geri dönüşüm havuz ve 3) S2 S1 aynı havuzun bir fonksiyonu olarak tanımlanmış herhangi bir SV havuzu göreli büyüklüğü bir fonksiyonu olarak S2 havuzları göreceli büyüklüğü (RRP ve RP). Bu özel protokol alma süresi (kinetik ölçümler için satın alma süreleri mümkün ve görüntü yakalamak için senkronize otomatik olarak boşaltma gibi hızlı olmalıdır) çok yavaş olduğundan, ancak boşaltma kinetiği hakkında bilgi vermek olmaz.
30 Hz 2 s uyaranlara hipertonik sakaroz 8 boşaltma RRP özdeş bir ölçüde çağrıştırıyor. RRP boyutu bu yanahipertonik sakaroz boşaltma 15 tarafından tanımlanan, hipokampal nöronların 16 çalışmaları ile anlaşma bu protokol tüm RRP SV kaldırır ifade edebiliriz. Rezerv havuzu, 400 uyaranlara Bu uyarının bu yana (40 Hz 10 sn)% 95, tüm boya etiketli SV tüketir bir paradigma (50 mM KCl ile 2 uyaranlara) benzer bir miktarda boya kaldırır üç trenler neredeyse tamamen tükenmiş 8,17. Doğru kantifikasyon RRP ve rezerv havuzu her iki boyutu da CCD kamera doğrusal dinamik aralık içinde bilgi edinme bağlıdır.
Bu basit bir protokol daha da değiştirilebilir. Yükleme uyaranların gücü de nöronal aktivitenin nasıl ve farklı endositoz modları SV havuzu ikmal etkileyen belirlemek için çeşitli olabilir. Ayrıca, gerekirse iki kür daha fazla yükleme ve boşaltma yapılabilir. Bu protokol transfekte hücreler aşırı ekspresyonu ya da kullanılabilirshRNA vektörler. Birincil nöronal kültürlerin düşük transfeksiyon verimliliği nedeniyle, ifade proteinler floresan proteinleri ile etiketlenmiş olmalıdır. Bu fluoresan etiketleri (örneğin, camgöbeği veya kırmızı proteinler) FM boya sinyal ile müdahale etmediğini esastır. Bu durumda, aynı alanda görüş transfekte ve non-transfekte hücreler sinir uçları, aynı zamanda ek bir kontrol 8 olarak karşılaştırılabilir. Pertürbasyon yüklerin sırasında mevcut olduğundan, bu tür deneylerde, S1 ve S2 yükler arasında yükleme ölçüde bir karşılaştırma çok az değer taşır. SV havuzları arasında boya bölümleme hala ancak 8 görüntülendi olabilir.
Genetik gazetecilere pHluorins primer nöronal kültür SV ekzositoz ve endositoz izlemek için istihdam edilebilir çağırdı. Bu probları VAMP, sinaptofizin ve VGLUT1 18 olarak etiketlenen SV proteinler luminal etki pH ortamı pH duyarlı yeşil flüoresan protein </sup> Veziküler ATPaz inhibitörleri ile birlikte kullanıldığında, pHluorins SV havuzu seferberlik 19 kinetiği ve kapsamı hem de rapor edebilirsiniz . FM-boya dayalı bir yaklaşım, burada açıklanan pHluorin tekniği üzerinde bazı avantajları vardır, Öncelikle, FM boyalar SV endositoz modu RRP ve rezerv havuzları 8 takviye yapar hangi bilgileri sağlar . İkincisi özel SV havuzları, 20 farklı spektral özellikleri ve nihayet transfeksiyon için hiçbir gereklilik yoktur FM boyalarla etiketli olabilir . Görülebilmesi için endositoz sırasında boya ile yüklenmesi gerekir beri tanımı SV FM boyalar, dinlenme ve ancak SV havuzları geri dönüşüm (pHluorins 19 kontrast) arasında SV trafik hakkında bilgi sağlayamaz. Böylece FM boyalar ve pHluorins hem de güçlü ve zayıf yanları var ve aynı soruyu adresine bağımsız deneylerde kullanılan en güçlüsüdür.
Yüksek kaliteli görüntüleri, geçerli analiz ve reproducib için gerekli olanle sonuçları. Yatay sürüklenme kolayca düzeltilebilir iken, Z ekseninde bir kayma var deneyler geri alınamaz. Bu nedenle, S1 ve S2 kaldırır başlamadan önce görüntü tekrar odaklanmak için önemlidir. Önemli bir floresan çürüme meydana geldi durumlarda, çürüme düzeltmeler (genellikle stimülasyon yokluğunda FM yüklü hücrelerin önceden kaydedilmiş bir iz çıkarılarak) uygulanabilir. Ancak, herhangi bir kantitatif analiz için kullanılacak grafik gösterimi ve çürüme düzeltme için gerçekleştirildiğini öne sürülmektedir.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, Wellcome Trust (Ref: 084.277) bir hibe ile desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalogue no. |
|---|---|---|
| AxioCam MRm Rev. 3 Digital Camera | Carl Zeiss | 4265099901000 |
| Axio Observer.A1 Microscope | Carl Zeiss | 4310040000000 |
| Cell culture plates (6 wells) | Greiner bio-one | 657160 |
| Centrifuge (Universal 32R) | Hettich Zentrifugen | 1610 |
| CO2 incubator | Heraeus Instruments | 51014042 |
| Falcon tubes (15/50 ml) | Greiner bio-one | 188271/210261 |
| Fluar 20X /0.75 ∞/0.17 Objective | Carl Zeiss | 4401459901000 |
| Glass coverslips (Ø25mm) | VWR international | 631-1584 |
| Glass pasteur pipettes (230 nm) | Greiner bio-one | 612-1799 |
| Haemocytometer | VWR | 15170-170 |
| Imaging chamber | Warner | RC-21 BRFS |
| Laminar flow hood | BIOHIT | VLF BHS 1200 |
| McIlwain Tissue Chopper | Mickle Laboratory Engineering Co. Ltd. | MTC/2 |
| Mercury lamp | Carl Zeiss | HBO 103 |
| MultiStim System Electrical Stimulator (100mV, 1ms pluse width) | Digitimer Ltd. | D330 |
| Perfusion pump | Watson-Marlow | 313S |
| Serological Pipettes (5/10/25 ml) | Greiner bio-one | 606180/607180/760180 |
| Shutter controller | Carl Zeiss | MAC5000 |
| Syringe (20 ml) | BD Plastipak | ST01-B002 |
| Syringe Filters (Minisart – 0.20 μm) | Sartorius Stedim | 16532 |
| VC-6 Six Channel valve controller | Warner | 64-0135 |
| YFP Filter set (Set 46) | Carl Zeiss | 1196-681 |
Table 1. Specific equipment and apparatus used
| Name | Company | Catalogue no. | Concentration |
|---|---|---|---|
| FM1-43 | Cambridge BioScience | BT70021 | 10 μM |
| FM2-10 | Cambridge BioScience | BT70044 | 100 μM |
| Poly-D-lysine | Sigma | P7886 | 15 μg/ml |
| Silicone grease | Sigma | 85403 | – |
Table 2. Specific reagents used
| Name | Company | Catalogue no. | Concentration |
|---|---|---|---|
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A4503 | 0.3% |
| D-Glucose | Sigma | G5767 | 0.25% |
| MgSO4·7H2O | Sigma | M2773 | 1.5 mM |
| D-PBS | Gibco | 21300 | 960 mg/100 ml |
-make 100ml fresh for each preparation
-sterile filter before use
Table 3. Solution B for CGN preparation
| Name | Company | Catalogue no. | Concentration |
|---|---|---|---|
| Solution B | – | – | 19 ml |
| Trypsin (5 mg/ml stock, -20°C) | Sigma | T9201 | 1 ml |
Table 4. Solution T for CGN preparation
| Name | Company | Catalogue no. | Concentration |
|---|---|---|---|
| Solution C | – | – | 3.2 ml |
| Solution B | – | – | 16.8 ml |
Table 5. Solution W for CGN preparation
| Name | Company | Catalogue no. | Concentration |
|---|---|---|---|
| Deoxyribonuclease (DNase, 500 U per 0.5 ml stock, -20°C) | Sigma | D5025 | 0.5 ml |
| MgSO4· 7H2O | Sigma | M2773 | 1.5 mM |
| Solution B | – | – | 10 ml |
| Soybean trypsin inhibitor (SBTI, 0.5 mg per 0.5 ml stock, -20°C) | Sigma | T9003 | 0.5 ml |
Table 6. Solution C for CGN preparation
| Name | Company | Catalogue no. | Concentration |
|---|---|---|---|
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A4503 | 4% |
| Earle’s Balanced Salt Solution (EBSS) | Gibco | 24010 | 10 ml |
| MgSO4· 7H2O | Sigma | M2773 | 3 mM |
Table 7. EBSS Solution for CGN preparation
| Name | Company | Catalogue no. | Concentration |
|---|---|---|---|
| Cytosine β-D-arabinofuranoside (Ara-C) * | Sigma | C1768 | 10 μM |
| Foetal Bovine Serum | Gibco | 10106 | 10 % |
| D-Glucose | Sigma | G5767 | 30 mM |
| L-Glutamine | Sigma | G3126 | 2 mM |
| KCl | Sigma | P5405 | 25 mM |
| Minimal Essential Medium (MEM) | Gibco | 21090 | 500 ml |
| Penicillin (P)/Streptomycin (S) | Gibco | 15140 | 100 U/ml (P), 100 μg/ml (S) |
*Ara-C should be added to medium from 1 DIV onwards
Table 8. Culture Media for CGN preparation
| Name | Version | Company |
|---|---|---|
| AxioVision Rel. | 4.8 | Carl Zeiss |
| ImageJ | 1.42q | National Institutes of Health |
| Microsoft Excel | 2003 | Microsoft |
Table 9. Specific computer software used
| Name | Company | Catalogue no. | Concentration |
|---|---|---|---|
| CaCl2 · 2H2O | Sigma | C7902 | 1.3 mM |
| Glucose | Sigma | G5767 | 5 mM |
| KCl | Sigma | P5405 | 3.5 mM |
| KH2PO4 | Sigma | P9791 | 0.4 mM |
| MgCl2·6H2O | Sigma | M0250 | 1.2 mM |
| NaCl | Fluka | 71378 | 170 mM |
| NaHCO3 | Fluka | 71627 | 5 mM |
| Na2SO4 | BDH Laboratory Supplies | 10264 | 1.2 mM |
| TES | Sigma | T1375 | 20 mM |
Table 10. Saline Solution (pH 7.4)
References
- Rizzoli, S. O., Betz, W. J. Synaptic vesicle pools. Nat. Rev. Neurosci. 6, 57-69 (2005).
- Sudhof, T. C. The synaptic vesicle cycle revisited. Neuron. 28, 317-320 (2000).
- Evans, G. J., Cousin, M. A. Activity-dependent control of slow synaptic vesicle endocytosis by cyclin-dependent kinase 5. J. Neurosci. 27, 401-411 (2007).
- Clayton, E. L., Cousin, M. A. Differential labelling of bulk endocytosis in nerve terminals by FM dyes. Neurochem. Int. 53, 51-55 (2008).
- Clayton, E. L., Evans, G. J., Cousin, M. A. Bulk synaptic vesicle endocytosis is rapidly triggered during strong stimulation. J. Neurosci. 28, 6627-6632 (2008).
- Cousin, M. A. Use of FM1-43 and other derivatives to investigate neuronal function. Curr. Protoc. Neurosci. Chapter 2, Unit 2-Unit 2 (2008).
- Clayton, E. L. The phospho-dependent dynamin-syndapin interaction triggers activity-dependent bulk endocytosis of synaptic vesicles. J. Neurosci. 29, 7706-7717 (2009).
- Cheung, G., Jupp, O. J., Cousin, M. A. Activity-dependent bulk endocytosis and clathrin-dependent endocytosis replenish specific synaptic vesicle pools in central nerve terminals. J. Neurosci. 30, 8151-8161 (2010).
- Betz, W. J., Mao, F., Smith, C. B. Imaging exocytosis and endocytosis. Curr. Opin. Neurobiol. 6, 365-371 (1996).
- Ryan, T. A., Reuter, H., Smith, S. J. Optical detection of a quantal presynaptic membrane turnover. Nature. 388, 478-482 (1997).
- Murthy, V. N., Sejnowski, T. J., Stevens, C. F. Heterogeneous release properties of visualized individual hippocampal synapses. Neuron. 18, 599-612 (1997).
- Tan, T. C. Cdk5 is essential for synaptic vesicle endocytosis. Nat. Cell. Biol. 5, 701-710 (2003).
- Anggono, V., Cousin, M. A., Robinson, P. J. Styryl dye-based synaptic vesicle recycling assay in cultured cerebellar granule neurons. Methods. Mol. Biol. 457, 333-345 (2008).
- Gallo, V. Selective release of glutamate from cerebellar granule cells differentiating in culture. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 79, 7919-7923 (1982).
- Stevens, C. F. Neurotransmitter release at central synapses. Neuron. 40, 381-388 (2003).
- Mozhayeva, M. G. Development of vesicle pools during maturation of hippocampal synapses. J. Neurosci. 22, 654-665 (2002).
- Cousin, M. A., Evans, G. J. O. Activation of silent and weak synapses by cAMP-dependent protein kinase in cultured cerebellar granule neurons. J. Physiol. 589, 1943-1955 (2011).
- Kim, S. H., Ryan, T. A. Synaptic vesicle recycling at CNS synapses without AP-2. J. Neurosci. 29, 3865-3874 (2009).
- Kim, S. H., Ryan, T. A. Cdk5 serves as a major control point in neurotransmitter release. Neuron. 67, 797-809 (2010).
- Groemer, T. W., Klingauf, J. Synaptic vesicles recycling spontaneously and during activity belong to the same pool. Nat. Neurosci. 10, 145-147 (2007).
