Drosophila popstadium Buik Immunohistochemie

1. Dag 1 Voordat u begint: Een gezonde bevolking van vliegen moet worden gehandhaafd met behulp van standaard protocollen kweken: verwijder volwassenen uit flessen of flacons na 3-4 dagen van ei-lay en laat ontwikkeling tot bij een constante temperatuur te gaan tot zwerven 3 e instar larven te starten verpopping. Het larvale / popstadium overgang wordt gekenmerkt door de vorming van de prepupae (als 0 uur na puparium vorming-APF). Immobiele poppen onderscheiden zich van oudere poppen door hun witte kleur en van larven die nog niet verpopping begonnen door hun langwerpige, afgeronde vorm en uitpuilen van de voorste siphonen. Je hebt nodig: Een kwast voor het verzamelen van poppen Een vochtige kamer voor het kweken van poppen: een petrischaal bekleed met papieren handdoek nat en bedekt met filtreerpapier gemarkeerd voor de verschillende tijdstippen van inzameling, genotype of het geslacht van de poppen 1X fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) voor het wassen poppen Verzamelen, kweken en staging poppen Met behulp van een vochtig penseel verwijder voorzichtig 0hr APF poppen van cultuur flessen / flacons en plaats ze in het deksel van de vochtige kamer. Met behulp van de penseel en 1X PBS voorzichtig wassen de poppen aan vuil te verwijderen uit de pop geval Indien nodig sorteert de poppen naar geslacht. De gonaden primordia van de poppen gebruikt kan worden om de seksen te sorteren. De mannelijke gonaden primordia zijn een laterale paar doorzichtige schijven eenvoudig gezien door het popstadium opperhuid ongeveer 2 / 3 over de lengte van het lichaam 5. De vrouwelijke gonaden primordia zijn kleiner en niet zo gemakkelijk te herkennen. Plaats de poppen in de juiste label positie in de vochtige kamer en ga terug naar constante temperatuur. Cultuur aan de juiste ontwikkeling tijdstip. 2. Dag 2: Dissection, fixatie en primaire antilichaam incubatie Voordat u begint: Je hebt nodig: Dissection stereomicroscoop Chirurgische tang Chirurgische scalpel met nummer 11 bladen Twee van negen goed glas depressie schalen (Corning product # 7220-85) Vul putten van een schotel met 1X PBS: Dit is de spoeling gerecht voor het reinigen ontleed poppen Vul de putten van de tweede schotel met fixatie buffer Vochtige kamer voor antilichaam incubatie. We maken gebruik van plastic afsluitbaar sandwich boxen bekleed met nat keukenpapier. Fixatie buffer: 1x PBS, 4% paraformaldehyde, 0,2% deoxycholinezuur (voor permeabilisatie) Dissection platform: Clear microscoopglaasje met een stukje dubbelzijdig plakband gehandeld op grond van een kant 1X PBS P100 of P200 pipet Ontleding Met behulp van een tang voorzichtig verwijderen poppen een voor een tijd en plaats ze op de dissectie platform met de voorste einde van de poppen waarmee de breedste breedte van de tape. Als poppen zijn te natte, eerst dep ze droog met een papieren handdoek. Voordat de poppen volledig gehandeld op grond van de tape, gebruik dan een penseel om ze positie. Laat de poppen aan de lucht drogen en zich te houden aan de tape (5-10 minuten) Met de chirurgische scalpel bilateraal ontleden elk poppen. Dit kan het beste bereikt met een enkele snelle snede van de voorste naar de achterste einde van de poppen. Als dit goed wordt gedaan, zal de cut halveren zowel de voorste en achterste siphonen paren. Ontleden niet meer dan 10 poppen in een tijd als wassen en schoonmaken van de monsters snel is nodig om te voorkomen proteolytische schade aan het weefsel. Met behulp van een penseel, overdracht van een kleine hoeveelheid 1X PBS aan elk ontleed poppen om hen los te maken van de tape. Reiniging, fixatie en primaire antilichaam incubatie Met een paar chirurgische tang te vatten een individuele pop half naar voren en onmiddellijk onder te dompelen in een put van de spoelen schotel. De dissectie platform moet worden vervangen door de spoelen schotel op de microscoop podium. De poppen geval moet worden overgelaten aan het monster tot de verwerking is voltooid en monsters zijn klaar voor montage. Hoewel nog steeds grijpen de pop half gebruik maken van een pipet om zachtjes weg te wassen de interne weefsel van de buik. Te veel druk tijdens het wassen kan leiden tot verlies van epitheliale cellen. Onmiddellijk overdracht van de schone pop half tot fixatie buffer op kamertemperatuur en evenzo proces de resterende pop helften. Met de praktijk, dissectie en het wassen van 20 pop helften moeten nemen minder dan 5 minuten. Laat poppen in fixatie buffer incuberen bij kamertemperatuur gedurende 1 (een) uur. Spoel vaste poppen 3x vijf minuten in 1X PBS Monsters kunnen direct worden verwerkt voor immunohistochemie of kunnen worden opgeslagen in 100% ethanol bij -20 ° C voor maximaal 3 maanden zonder verlies van cellen of epitoop reactiviteit. Voor het opslaan van monsters, evenwicht monsters door een verdunningreeks van PBS: EtOH (3:1, 1:1, 1:3) bij kamertemperatuur gedurende 20 minuten in elke verdunning voorafgaand aan de overdracht tot 100% EtOH. De monsters moeten opnieuw in evenwicht worden in PBS door middel van de reverse-serie voor de verwerking voor immunohistochemie. Block monsters in 1x PBS (aangevuld met 2% bovine serum albumine) voor 1 (een) uur voor de toevoeging van primaire antilichaam. Incubeer met primaire antilichaam verdund tot de juiste concentratie in 1X PBS gedurende de nacht bij 4 ° C zonder schommelen. 3. Dag 3: tweede antilichaam incubatie, montage en imaging Voordat u begint: Je hebt nodig: Twee chirurgische pincet Montage media (glycerol, Vectashield [Vector Labs], of Slowfade Gold [Invitrogen]) Depressie goed objectglaasjes (0,8 mm) Dekglaasjes (24 x 40 mm) Secundair antilichaam incubatie en montage: Was de monsters 3x 10 minuten met elk 1x PBS Block monsters in 1x PBS (aangevuld met 2% bovine serum albumine) voor 1 (een) uur voor de toevoeging van secundaire antilichaam. Incubeer met secundair antilichaam verdund tot de juiste concentratie in 1X PBS bij kamertemperatuur in het donker zonder schokken voor 3 (drie) uur. Was de monsters 3x 10 minuten met elk 1x PBS In voorkomend geval, tegenkleuring poppen (Voorbeeld we kernen vlek met DAPI [4 ',6-diamidino-2-phenylindole] verdund in PBS gedurende 10 minuten). Equilibreren monsters (minimaal 30 minuten) in geschikte media voor de montage. Bereid een sample dia. De morfologie van de poppen voorkomt vlakke montage. Monsters zijn gemonteerd in de put van een depressie slide (drop dia) voor de beeldvorming. Plaats 75-100ul van montage media in de depressie goed. Meerdere monsters kunnen worden gemonteerd op een enkele dia. De pop geval moet worden verwijderd van de monsters voor de montage. Pak een individueel pop geval naar voren dat zeker niet aan de interne popstadium membraan begrijpen. Met een tweede tang voorzichtig te begrijpen van de interne popstadium membraan door het hoofd en verwijder deze uit het popstadium geval. Onmiddellijk het monster goed over te dragen aan de depressie en verder te verwerken aanvullende monsters. Met behulp van een sonde of een pincet positie van de monsters gelijkmatig in de depressie goed aan bij de laterale oppervlak naar boven. Af en toe luchtbellen kunnen verwijderd worden met een sonde. Laat het dekglaasje op de monsters die zorgen dat er geen luchtbellen te introduceren 4. Representatieve resultaten: Monsters bereid met behulp van dit protocol behouden de bruto morfologie van de volwassen buik. Afbeelding stacks kunnen worden geprojecteerd op een twee-dimensionaal beeld of 3-D rendering kunnen worden toegepast op buik topologie te onderzoeken genereren. Figuur 1. Segmentatie genproducten in Drosophila poppen Wingless eiwit-en Engrailed expressie (En-GAL4: UAS-GFP). Werden gevisualiseerd op 26 uur na puparium vorming (APF) met muis anti-Wg (4D4: Iowa Hybridoma Bank) en anti-GFP. 10x vergroting, voorste is links en dorsale om is. Nucleii werden tegengekleurd met DAPI. Stapels van ongeveer 50 beelden (ΔZ tussen plakken is 2.5μm) werden geprojecteerd.