ذبابة الفاكهة المناعية العذراء البطن
Summary
تلوين الأجسام المضادة من<em> ذبابة الفاكهة</em> الشرانق يمكن تعزيز التحليلات الجينية الوراثة الكبار التنموية في البطن. نقدم لدينا بروتوكول تلطيخ تشريح ، وتثبيت الأجسام المضادة للنظم<em> ذبابة الفاكهة</em> البطن العذراء.
Abstract
بطن العذراء ذبابة الفاكهة هو نظام أنشئ نموذج لدراسة التشكل الظهارة وتطوير morphologies جنسيا ديمبرافيك 1-3. خلال pupation ، الذي يمتد نحو 96 ساعة (عند 25 درجة مئوية) ، والسكان من الخلايا المتكاثرة تخيلي استبدال البشرة اليرقات لإنشاء شرائح البالغين في البطن. تخيلي هذه الخلايا ، ولدت خلال مرحلة التطور الجنيني ، كما توجد أزواج الوحشي للأعشاش أرومة منسجة في كل جزء من البطن اليرقات. أربعة أزواج من أعشاش أرومة منسجة تؤدي إلى إهاب الظهرية الكبار (أعشاش الظهري الأمامي والخلفي) ، وإهاب بطني (أعشاش بطني) وspiracles المرتبطة بكل قطعة (منتفس أعشاش) 4. puparation على هذه الخلايا مضاعفا (مميزة من حيث حجم أكبر من اليرقات المتعددة الصبغيات موظفين المدنيين المحليين خلايا البشرة) بدء عملية النمطية للهجرة ، والانتشار واستبدال موظفين المدنيين المحليين. ويمكن استخدام مختلف الأدوات الجزيئية والجينية للتحقيق في مسارات مساهمات الجينية التي تساهم في التشكل من البطن الكبار. عادة يتم تحليل الظواهر الكبار النهائي تشريح التالية من البشرة البطن الكبار. ومع ذلك ، والتحقيق في العمليات الجزيئية الكامنة وراء يتطلب تحليلات المناعى للظهارة العذراء ، والتي تشكل تحديات فريدة من نوعها. زمنيا التشكل الحيوي والتفاعلات من المجموعتين السكانيتين الظهارية مميزة (اليرقات وتخيلي) توليد الأنسجة الهشة عرضة لفقدان الخلية المفرطة خلال تشريح ومعالجة لاحقة. وقد طورنا أساليب التشريح ، التثبيت ، وتصاعد والتصوير من ذبابة الفاكهة abdominem ظهارة العذراء للدراسات المناعى التي تولد متسقة عينات عالية الجودة مناسبة لالمجهري الفلورسنت مبائر أو القياسية.
Protocol
Discussion
ويمكن استخدام التقنيات المعروضة في هذا الفيديو لإعداد عذارى ذبابة الفاكهة من مجموعة متنوعة من النقاط الزمنية التنموية. الشرانق معالجتها خلال الفترة من 24 ساعة إلى 32 ساعة APF APF هي الأكثر عرضة لفقدان الخلية من الظهارة. استخدام المنظفات (مثل 100 – X تريتون وتوين 20) خلال الخطوات حضانة طويلة يزيد من احتمال فقدان الخلية وبالتالي لا يوصى. بدلا من ذلك ، يتم استخدام حمض deoxycholic باعتبارها خطوة المنظفات خلال التثبيت الأولي. يتم تنفيذ جميع الخطوات اللاحقة في برنامج تلفزيوني 1X دون المنظفات. بالإضافة إلى ذلك ، هزاز عينات خلال الخطوات حضانة طويلة يزيد من فقدان الخلية ويجب تجنبها.
ولا يمكن تصوير العينات باستخدام تقنيات الفحص المجهري متحد البؤر. ويمكن أيضا ومع ذلك ، ذبابة الفاكهة الشرانق معالجتها كما هو موضح يمكن تصوير المجهري باستخدام الإضاءة هيكلة النظام العائد جودة الصورة مشابهة لتقنيات مبائر.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل من خلال منحة من مؤسسة العلوم الوطنية.
Materials
- Dissection stereomicroscope
- Surgical forceps
- Surgical scalpel with number 11 blades
- Nine-well glass depression dishes (Corning product # 7220-85)
- Humid chamber for culturing pupae
- 1X Phosphate buffered saline (PBS)
- #11 surgical scalpel
- double-sided tape
- Fixation buffer: 1x PBS, 4% paraformaldehyde, 0.2% deoxycholic acid (for permeabilization)
- p100 or p200 pipettor
- Depression well microscope slides (0.8 mm)
References
- Kopp, A., Duncan, I. Anteroposterior patterning in adult abdominal segments of Drosophila. Dev. Biol. 242, 15-30 (2002).
- Ninov, N., Chiarelli, D. A., Martin-Blanco, E. Extrinsic and intrinsic mechanisms directing epithelial cell sheet replacement during Drosophila metamorphosis. Development. 134, 367-379 (2007).
- Bischoff, M., Cseresnyes, Z. Cell rearrangements, cell divisions and cell death in a migrating epithelial sheet in the abdomen of Drosophila. Development. 136, 2403-2411 (2009).
- Matsuda, R. in Morphology and evolution of the insect abdomen. , (1976).
- Kerkis, J. The Growth of the Gonads in Drosophila Melanogaster. Genetics. 16, 212-224 (1931).
