Summary

L'uso di una trappola ottica per lo Studio delle interazioni ospite-patogeno per Dynamic Imaging Live Cell

Published: July 28, 2011
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Summary

Un metodo è descritto per selezionare individualmente, manipolare e agenti patogeni immagine dal vivo utilizzando una trappola ottica accoppiato ad un microscopio a disco rotante. La trappola ottica fornisce il controllo spaziale e temporale di organismi e li adiacenti alle cellule ospite. Microscopia a fluorescenza cattura le interazioni intercellulare perturbazione con minimo di cellule.

Abstract

Immagini dinamiche delle cellule vive permette la visualizzazione diretta in tempo reale delle interazioni tra le cellule del sistema immunitario 1, 2, tuttavia la mancanza di controllo spaziale e temporale tra la cellula fagocitica e microbo ha reso focalizzato osservazioni sulle interazioni iniziale di risposta dell'ospite ad agenti patogeni difficili. Storicamente, gli eventi di contatto intercellulare come la fagocitosi 3 sono stati ripreso miscelando due tipi di cellule, e poi continuo la scansione del campo visivo per trovare serendipitous contatti intercellulari nella fase appropriata di interazione. La natura stocastica di questi eventi rende questo processo noioso, ed è difficile osservare gli eventi in anticipo o in fugace contatto cellula-cellula da questo approccio. Questo metodo richiede trovando le coppie di cellule che sono sul punto di contatto, e osservando loro fino a quando consumato il loro contatto, o non. Per far fronte a queste limitazioni, usiamo trapping ottico come un non-invasivo, il metodo non distruttivo, ma veloce ed efficace per posizionare le cellule in coltura.

Trappole ottiche o pinzette ottiche, sono sempre più utilizzati nella ricerca biologica per catturare e manipolare le cellule fisicamente e altri micron di particelle di dimensioni in tre dimensioni 4. Pressione di radiazione è stato osservato e applicato ai sistemi pinzetta ottica nel 1970 5, 6, e fu usato per controllare campioni biologici nel 1987 7. Da allora, pinzette ottiche hanno maturato in una tecnologia per sondare una varietà di fenomeni biologici 8-13.

Descriviamo un metodo 14 che avanza dal vivo imaging cellulare, integrando una trappola ottica con la filatura microscopia confocale disco con controllo di temperatura e umidità per fornire squisita controllo spaziale e temporale di organismi patogeni in un ambiente fisiologico per facilitare le interazioni con le cellule ospiti, come determinato dal operatore. Live, gli organismi patogeni come Candida albicans e Aspergillus fumigatus, che può causare potenzialmente letale, infezioni invasive nei soggetti immunocompromessi 15, 16 (ad esempio l'AIDS, chemioterapia, pazienti e organo trapianto), erano intrappolati otticamente con tecniche non distruttive intensità laser e si è trasferito adiacente al macrofagi, in grado di fagocitare l'agente patogeno. Alta risoluzione, filmati luce trasmessa e fluorescenza basato stabilito la capacità di osservare gli eventi iniziali della fagocitosi nelle cellule viventi. Per dimostrare l'applicabilità ampio in immunologia, primario cellule T sono stati intrappolati e manipolati per formare sinapsi con anti-CD3 microsfere rivestite in vivo, e time-lapse imaging di formazione di sinapsi è stato ottenuto. Fornendo un metodo per esercitare avere un controllo spaziale di agenti patogeni vivono rispetto alle cellule immunitarie, le interazioni cellulari possono essere catturate al microscopio a fluorescenza con perturbazione minima di cellule e può produrre una potente visione prime risposte dell'immunità innata e adattativa.

Protocol

1. Condizioni di coltura di agenti patogeni per l'intrappolamento ottico Crescere A. fumigatus (B-5233/RGD12-8) su un semi-solido agar contenente SBD (Sabouraud destrosio) 30 ° C per 3 giorni. Crescere C. albicans (SC5314) in YPD (Lievito peptone destrosio) coltura liquida contenente 100 mg / ml ampicillina notte in un incubatore shaker a 30 ° C. 2. Preparazione di agenti patogeni per l'etichettatura fluorescente Raccolta desi…

Discussion

In questo lavoro si usa una trappola ottica di catturare patogeni con dimensioni tra i 3 micron – 5 micron. Anche se gli agenti patogeni di interesse al nostro laboratorio hanno tipicamente queste dimensioni, il sistema di pinzetta ottica qui descritto è flessibile per intrappolare una vasta gamma di formati. In realtà le trappole ottiche sono stati utilizzati per catturare le particelle che vanno da singoli atomi alle cellule di circa 10 micron di diametro. Inoltre, questo sistema di intrappolamento ottico è in grad…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo lavoro è stato sostenuto dal Massachusetts General Hospital Dipartimento di Medicina fondi interni (JMT, MKM, MLC, JMV), National Institute of Biomedical Imaging e Bioingegneria concedere T32EB006348 (CEC), Center del Massachusetts General Hospital per finanziare Biologia Computazionale e Integrative sviluppo e AI062773 ( RJH), borse di studio AI062773, DK83756, e DK 043351 (RJX), NSF 0.643.745 (MJL), NIH R21CA133576 (MJL) e Istituto Nazionale di allergie e malattie infettive (NIAID) dei National Institutes of Health (NIH) AI057999 (JMV ). Ringraziamo Nicola C. Yoder per le discussioni utili, e Feltri Carlo (RPI, Inc.) per l'assistenza tecnica.

Materials

Name of the reagent Company Catalogue number Comments (optional)
A. fumigatus     Albino strain, B-5233/RGD12-8, gift from K.J. Kwon-Chung, NIH
C. albicans     SSY50-B mutant, gift from Eleftherios Mylonakis, MGH; SC5314 strain, gift from Gerald Fink, Whitehead Institute
Alexa Fluor 488 Invitrogen A20000  
Alexa Fluor 647 Invitrogen A20006  
dimethylformamide Sigma D4551  
Fresh blood     Gift from R.J.W. Heath, MGH, HMS
Nikon inverted microscope Nikon   Model Ti-E
Trapping laser, ChromaLase Blue Sky Research CLAS-106-STF02-02  
Fluorescence excitation laser Coherent   Model Innova 70C
Breadboards for trapping components Thorlabs MB1224, MB1218  
Optical air table Technical Manufacturing Corporation    
Electronic shutter with pedal control Uniblitz   Purchased from Vincent Associates, Rochester, NY
Singlemode optical fiber Oz Optics PMJ-3S3S-1064-6  
Fiber positioner Thorlabs PAF-X-5-C  
Fiber collimator Oz Optics HPUCO-23-1064-P-25AC  
Lenses for telescope Thorlabs AC254-150-B Focal length of 150 mm
Translation stages (x, y, z) Newport M-461-XYZ  
IR dichroic mirror Chroma ET750-sp-2p8  
Objective lens (100X) Nikon   NA = 1.49, oil immersion, TIRF objective
Confocal head Yokogawa CSU-XI  
Polarizer Nikon MEN51941  
Wollaston prism Nikon MBH76190  
EM-CCD camera Hamamatsu C9100-13  
CCD camera (ORCA ER) Hamamatsu C4742-80-12AG  
Filter wheel Ludl 99A353  
Filter wheel Sutter LB10-NWE  
Chambered coverglass Lab-Tek/Nunc 155409  
Dynabeads Invitrogen 111-51D Coated with anti-CD3
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) Invitrogen/Gibco 10313  
Penicillin/streptomycin Invitrogen/Gibco 15140-122  
L-glutamine Invitrogen/Gibco 25030-081  
Fetal Bovine Serum (HyClone) ThermoScientific SH30071.03  

References

  1. Grakoui, A. The immunological synapse: A molecular machine controlling T cell activation. Science. 285, 221-227 (1999).
  2. Monks, C. R. Three-dimensional segregation of supramolecular activation clusters in T cells. Nature. 395, 82-86 (1998).
  3. Stuart, L. M., Ezekowitz, R. A. Phagocytosis and comparative innate immunity: Learning on the fly. Nat Rev Immunol. 8, 131-141 (2008).
  4. Neuman, K. C., Block, S. M. Optical trapping. Rev Sci Instrum. 75, 2787-2809 (2004).
  5. Ashkin, A. Optical trapping and manipulation of neutral particles using lasers. Proc Natl Acad Sci USA. 94, 4853-4860 (1997).
  6. Ashkin, A. Acceleration and trapping of particles by radiation pressure. Phys Rev Lett. 24, 156-159 (1970).
  7. Ashkin, A., Dziedzic, J. Optical trapping and manipulation of viruses and bacteria Science. Nature. 235, 1517-1520 (1987).
  8. Khalil, A. S. Single M13 bacteriophage tethering and stretching. Proc Natl Acad Sci USA. 104, 4892-4897 (2007).
  9. Khalil, A. S. Kinesin’s cover-neck bundle folds forward to generate force. Proc Natl Acad Sci USA.. 105, 19247-19252 (2008).
  10. Li, Z. Membrane tether formation from outer hair cells with optical tweezers. Biophys J. , 1386-1395 (2002).
  11. Kim, S. The αβ T cell receptor is an anisotropic mechanosensor. J Biol Chem. 284, 31028-31028 (2009).
  12. Mohanty, S., Mohanty, K., Gupta, P. Dynamics of interaction of RBC with optical tweezers. Opt. Express. 13, 4745-4751 (2005).
  13. Tam, J. Control and manipulation of pathogens with an optical trap for live cell imaging of intercellular interactions. PLoS One. 5, e15215-e15215 (2010).
  14. Lin, S. J., Schranz, J., Teutsch, S. M. Aspergillosis case-fatality rate: Systematic review of the literature. Clin Infect Dis.. 32, 358-366 (2001).
  15. Wey, S. B. Hospital-acquired candidemia – the attributable mortality and excess length of stay. Arch. Intern. Med. 148, 2642-2645 (1988).

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Cite This Article
Tam, J. M., Castro, C. E., Heath, R. J. W., Mansour, M. K., Cardenas, M. L., Xavier, R. J., Lang, M. J., Vyas, J. M. Use of an Optical Trap for Study of Host-Pathogen Interactions for Dynamic Live Cell Imaging. J. Vis. Exp. (53), e3123, doi:10.3791/3123 (2011).

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