השימוש מלכודת אופטית לחקר מארח הפתוגן אינטראקציות עבור הדמיה דינמי תא חי
Summary
השיטה מתוארת בנפרד לבחור, לתפעל, ומזיקים התמונה לחיות באמצעות מלכודת אופטי מצמידים את מיקרוסקופ דיסק מסתובב. מלכודת אופטי מספק שליטה במרחב ובזמן של אורגניזמים ומקומות אותם סמוך לתאי המארח. מיקרוסקופ פלואורסצנטי לוכדת אינטראקציות אינטר דינמי עם הפרעה מינימלית תאים.
Abstract
תא דינמי הדמיה לחיות מאפשר ראיה ישירה בזמן אמת אינטראקציות בין תאים של המערכת החיסונית 1, 2, עם זאת, חוסר שליטה במרחב ובזמן בין תא חיידק phagocytic ויש שניתנו ממוקד תצפיות לתוך אינטראקציות התגובה הראשונית של המארח פתוגנים קשה. מבחינה היסטורית, אירועים לפנות אינטר כגון phagocytosis 3 כבר צילמו על ידי ערבוב של שני סוגי התאים, ולאחר מכן ברציפות סריקת השדה של נוף למצוא קשר אינטר סרנדיפי בשלב המתאים של אינטראקציה. אופי סטוכסטיים של אירועים אלה הופך את התהליך מייגע, וקשה לצפות באירועים מוקדם או חולף על קשר תאים תאים על ידי גישה זו. שיטה זו מחייבת מציאת זוגות סלולריים, כי הם על סף מגע, והתבוננות לפנות אותם עד שהם המושלם שלהם, או לא. כדי לענות על המגבלות האלה, אנו משתמשים השמנה אופטי כשיטה, לא פולשנית ולא הרסנית, אבל מהיר ויעיל למצב התאים בתרבית.
מלכודות אופטי, או פינצטה אופטית, מנוצלים ויותר המחקר הביולוגי כדי ללכוד פיסית לתפעל תאים אחרים מיקרון חלקיקים בגודל בשלושה ממדים 4. לחץ קרינה נצפתה הראשון ליישם מערכות פינצטה אופטית ב -1970 5, 6, ושימש הראשון לשלוט דגימות ביולוגיות בשנת 1987 7. מאז, פינצטה אופטית הבשילו לתוך הטכנולוגיה כדי לבחון מגוון של תופעות ביולוגיות 8-13.
אנו מתארים שיטה 14 כי ההתקדמות לחיות הדמיה התא על ידי שילוב של מלכודת אופטי עם דיסק מסתובב מיקרוסקופיה confocal עם בקרת טמפרטורה ולחות כדי לספק שליטה במרחב ובזמן מעולה של אורגניזמים פתוגניים בסביבה פיזיולוגיים כדי להקל על אינטראקציות עם תאים המארח, כפי שנקבע על ידי המפעיל. Live, אורגניזמים פתוגניים כמו קנדידה אלביקנס, אספרגילוס fumigatus, אשר יכול לגרום פוטנציאל קטלני, זיהומים פולשניים בקרב אנשים immunocompromised 15, 16 (למשל איידס, כימותרפיה, השתלת איברים לחולים), היו לכודים אופטית באמצעות שאינו הרסני בעוצמות לייזר ועבר סמוך מקרופאגים, אשר יכול phagocytose את הפתוגן. רזולוציה גבוהה, המשודר בסרטים אור פלואורסצנטי מבוססי הקים את היכולת להתבונן באירועים הראשונים של phagocytosis בתאים חיים. כדי להדגים את תחולתם רחבה באימונולוגיה, העיקרי מתאי T נלכדו גם מניפולציות כדי ליצור סינפסות עם אנטי CD3 microspheres מצופה in vivo, וגם זמן לשגות הדמיה של היווצרות הסינפסה הושג גם. על ידי מתן שיטה להפעיל שליטה מרחבית קנס של פתוגנים לחיות ביחס תאים חיסוניים, אינטראקציות הסלולר יכול להיות שנתפסו על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי עם הפרעה מינימלית תאים יכולה להניב תובנה עוצמה לתוך התגובות המוקדמות של חסינות מולדת ובעלי כושר הסתגלות.
Protocol
Discussion
בעבודה זו אנו משתמשים מלכודת אופטי ללכוד פתוגנים עם ממדים בין 3 מיקרומטר – 5 מיקרומטר. אמנם פתוגנים עניין במעבדה שלנו בדרך כלל יש ממדים אלה, מערכת פינצטה אופטית המתוארת כאן היא גמישה ללכוד מגוון רחב של גדלים. ואכן מלכודות אופטיות שימשו כדי ללכוד חלקיקים הנעים בין אטומי…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי החולים הכללי במסצ'וסטס מחלקת קופות לרפואה פנימית (JMT, MKM, MLC, JMV), המכון הלאומי הדמיה ביו Bioengineering מענק T32EB006348 (CEC), המרכז הכללי של מסצ'וסטס של החולים לקרן חישובית אינטגרטיבית פיתוח ביולוגיה AI062773 ( RJH), מענקים AI062773, DK83756 ו DK 043,351 (RJX), NSF 0,643,745 (MJL), NIH R21CA133576 (MJL), ואת המכון הלאומי לאלרגיה ומחלות זיהומיות (NIAID) של המכון הלאומי לבריאות (NIH) AI057999 (JMV ). אנו מודים ניקולס C. Yoder לדיונים מועיל, צ'רלס פלטס (RPI, Inc) לקבלת סיוע טכני.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| A. fumigatus | Albino strain, B-5233/RGD12-8, gift from K.J. Kwon-Chung, NIH | ||
| C. albicans | SSY50-B mutant, gift from Eleftherios Mylonakis, MGH; SC5314 strain, gift from Gerald Fink, Whitehead Institute | ||
| Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A20000 | |
| Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A20006 | |
| dimethylformamide | Sigma | D4551 | |
| Fresh blood | Gift from R.J.W. Heath, MGH, HMS | ||
| Nikon inverted microscope | Nikon | Model Ti-E | |
| Trapping laser, ChromaLase | Blue Sky Research | CLAS-106-STF02-02 | |
| Fluorescence excitation laser | Coherent | Model Innova 70C | |
| Breadboards for trapping components | Thorlabs | MB1224, MB1218 | |
| Optical air table | Technical Manufacturing Corporation | ||
| Electronic shutter with pedal control | Uniblitz | Purchased from Vincent Associates, Rochester, NY | |
| Singlemode optical fiber | Oz Optics | PMJ-3S3S-1064-6 | |
| Fiber positioner | Thorlabs | PAF-X-5-C | |
| Fiber collimator | Oz Optics | HPUCO-23-1064-P-25AC | |
| Lenses for telescope | Thorlabs | AC254-150-B | Focal length of 150 mm |
| Translation stages (x, y, z) | Newport | M-461-XYZ | |
| IR dichroic mirror | Chroma | ET750-sp-2p8 | |
| Objective lens (100X) | Nikon | NA = 1.49, oil immersion, TIRF objective | |
| Confocal head | Yokogawa | CSU-XI | |
| Polarizer | Nikon | MEN51941 | |
| Wollaston prism | Nikon | MBH76190 | |
| EM-CCD camera | Hamamatsu | C9100-13 | |
| CCD camera (ORCA ER) | Hamamatsu | C4742-80-12AG | |
| Filter wheel | Ludl | 99A353 | |
| Filter wheel | Sutter | LB10-NWE | |
| Chambered coverglass | Lab-Tek/Nunc | 155409 | |
| Dynabeads | Invitrogen | 111-51D | Coated with anti-CD3 |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Invitrogen/Gibco | 10313 | |
| Penicillin/streptomycin | Invitrogen/Gibco | 15140-122 | |
| L-glutamine | Invitrogen/Gibco | 25030-081 | |
| Fetal Bovine Serum (HyClone) | ThermoScientific | SH30071.03 |
References
- Grakoui, A. The immunological synapse: A molecular machine controlling T cell activation. Science. 285, 221-227 (1999).
- Monks, C. R. Three-dimensional segregation of supramolecular activation clusters in T cells. Nature. 395, 82-86 (1998).
- Stuart, L. M., Ezekowitz, R. A. Phagocytosis and comparative innate immunity: Learning on the fly. Nat Rev Immunol. 8, 131-141 (2008).
- Neuman, K. C., Block, S. M. Optical trapping. Rev Sci Instrum. 75, 2787-2809 (2004).
- Ashkin, A. Optical trapping and manipulation of neutral particles using lasers. Proc Natl Acad Sci USA. 94, 4853-4860 (1997).
- Ashkin, A. Acceleration and trapping of particles by radiation pressure. Phys Rev Lett. 24, 156-159 (1970).
- Ashkin, A., Dziedzic, J. Optical trapping and manipulation of viruses and bacteria Science. Nature. 235, 1517-1520 (1987).
- Khalil, A. S. Single M13 bacteriophage tethering and stretching. Proc Natl Acad Sci USA. 104, 4892-4897 (2007).
- Khalil, A. S. Kinesin’s cover-neck bundle folds forward to generate force. Proc Natl Acad Sci USA.. 105, 19247-19252 (2008).
- Li, Z. Membrane tether formation from outer hair cells with optical tweezers. Biophys J. , 1386-1395 (2002).
- Kim, S. The αβ T cell receptor is an anisotropic mechanosensor. J Biol Chem. 284, 31028-31028 (2009).
- Mohanty, S., Mohanty, K., Gupta, P. Dynamics of interaction of RBC with optical tweezers. Opt. Express. 13, 4745-4751 (2005).
- Tam, J. Control and manipulation of pathogens with an optical trap for live cell imaging of intercellular interactions. PLoS One. 5, e15215-e15215 (2010).
- Lin, S. J., Schranz, J., Teutsch, S. M. Aspergillosis case-fatality rate: Systematic review of the literature. Clin Infect Dis.. 32, 358-366 (2001).
- Wey, S. B. Hospital-acquired candidemia – the attributable mortality and excess length of stay. Arch. Intern. Med. 148, 2642-2645 (1988).
