Summary

השימוש מלכודת אופטית לחקר מארח הפתוגן אינטראקציות עבור הדמיה דינמי תא חי

Published: July 28, 2011
doi:

Summary

השיטה מתוארת בנפרד לבחור, לתפעל, ומזיקים התמונה לחיות באמצעות מלכודת אופטי מצמידים את מיקרוסקופ דיסק מסתובב. מלכודת אופטי מספק שליטה במרחב ובזמן של אורגניזמים ומקומות אותם סמוך לתאי המארח. מיקרוסקופ פלואורסצנטי לוכדת אינטראקציות אינטר דינמי עם הפרעה מינימלית תאים.

Abstract

תא דינמי הדמיה לחיות מאפשר ראיה ישירה בזמן אמת אינטראקציות בין תאים של המערכת החיסונית 1, 2, עם זאת, חוסר שליטה במרחב ובזמן בין תא חיידק phagocytic ויש שניתנו ממוקד תצפיות לתוך אינטראקציות התגובה הראשונית של המארח פתוגנים קשה. מבחינה היסטורית, אירועים לפנות אינטר כגון phagocytosis 3 כבר צילמו על ידי ערבוב של שני סוגי התאים, ולאחר מכן ברציפות סריקת השדה של נוף למצוא קשר אינטר סרנדיפי בשלב המתאים של אינטראקציה. אופי סטוכסטיים של אירועים אלה הופך את התהליך מייגע, וקשה לצפות באירועים מוקדם או חולף על קשר תאים תאים על ידי גישה זו. שיטה זו מחייבת מציאת זוגות סלולריים, כי הם על סף מגע, והתבוננות לפנות אותם עד שהם המושלם שלהם, או לא. כדי לענות על המגבלות האלה, אנו משתמשים השמנה אופטי כשיטה, לא פולשנית ולא הרסנית, אבל מהיר ויעיל למצב התאים בתרבית.

מלכודות אופטי, או פינצטה אופטית, מנוצלים ויותר המחקר הביולוגי כדי ללכוד פיסית לתפעל תאים אחרים מיקרון חלקיקים בגודל בשלושה ממדים 4. לחץ קרינה נצפתה הראשון ליישם מערכות פינצטה אופטית ב -1970 5, 6, ושימש הראשון לשלוט דגימות ביולוגיות בשנת 1987 7. מאז, פינצטה אופטית הבשילו לתוך הטכנולוגיה כדי לבחון מגוון של תופעות ביולוגיות 8-13.

אנו מתארים שיטה 14 כי ההתקדמות לחיות הדמיה התא על ידי שילוב של מלכודת אופטי עם דיסק מסתובב מיקרוסקופיה confocal עם בקרת טמפרטורה ולחות כדי לספק שליטה במרחב ובזמן מעולה של אורגניזמים פתוגניים בסביבה פיזיולוגיים כדי להקל על אינטראקציות עם תאים המארח, כפי שנקבע על ידי המפעיל. Live, אורגניזמים פתוגניים כמו קנדידה אלביקנס, אספרגילוס fumigatus, אשר יכול לגרום פוטנציאל קטלני, זיהומים פולשניים בקרב אנשים immunocompromised 15, 16 (למשל איידס, כימותרפיה, השתלת איברים לחולים), היו לכודים אופטית באמצעות שאינו הרסני בעוצמות לייזר ועבר סמוך מקרופאגים, אשר יכול phagocytose את הפתוגן. רזולוציה גבוהה, המשודר בסרטים אור פלואורסצנטי מבוססי הקים את היכולת להתבונן באירועים הראשונים של phagocytosis בתאים חיים. כדי להדגים את תחולתם רחבה באימונולוגיה, העיקרי מתאי T נלכדו גם מניפולציות כדי ליצור סינפסות עם אנטי CD3 microspheres מצופה in vivo, וגם זמן לשגות הדמיה של היווצרות הסינפסה הושג גם. על ידי מתן שיטה להפעיל שליטה מרחבית קנס של פתוגנים לחיות ביחס תאים חיסוניים, אינטראקציות הסלולר יכול להיות שנתפסו על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי עם הפרעה מינימלית תאים יכולה להניב תובנה עוצמה לתוך התגובות המוקדמות של חסינות מולדת ובעלי כושר הסתגלות.

Protocol

1. תרבות תנאים של פתוגנים עבור השמנה אופטי לגדול א fumigatus (B-5233/RGD12-8) על חצי מוצק מדיה אגר המכיל SBD (Sabouraud דקסטרוז) בשעה 30 ° C במשך 3 ימים. לגדול C. אלביקנס (SC5314) ב YPD (שמרים, Peptone דקסטרוז) תרבות…

Discussion

בעבודה זו אנו משתמשים מלכודת אופטי ללכוד פתוגנים עם ממדים בין 3 מיקרומטר – 5 מיקרומטר. אמנם פתוגנים עניין במעבדה שלנו בדרך כלל יש ממדים אלה, מערכת פינצטה אופטית המתוארת כאן היא גמישה ללכוד מגוון רחב של גדלים. ואכן מלכודות אופטיות שימשו כדי ללכוד חלקיקים הנעים בין אטומי…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה על ידי החולים הכללי במסצ'וסטס מחלקת קופות לרפואה פנימית (JMT, MKM, MLC, JMV), המכון הלאומי הדמיה ביו Bioengineering מענק T32EB006348 (CEC), המרכז הכללי של מסצ'וסטס של החולים לקרן חישובית אינטגרטיבית פיתוח ביולוגיה AI062773 ( RJH), מענקים AI062773, DK83756 ו DK 043,351 (RJX), NSF 0,643,745 (MJL), NIH R21CA133576 (MJL), ואת המכון הלאומי לאלרגיה ומחלות זיהומיות (NIAID) של המכון הלאומי לבריאות (NIH) AI057999 (JMV ). אנו מודים ניקולס C. Yoder לדיונים מועיל, צ'רלס פלטס (RPI, Inc) לקבלת סיוע טכני.

Materials

Name of the reagent Company Catalogue number Comments (optional)
A. fumigatus     Albino strain, B-5233/RGD12-8, gift from K.J. Kwon-Chung, NIH
C. albicans     SSY50-B mutant, gift from Eleftherios Mylonakis, MGH; SC5314 strain, gift from Gerald Fink, Whitehead Institute
Alexa Fluor 488 Invitrogen A20000  
Alexa Fluor 647 Invitrogen A20006  
dimethylformamide Sigma D4551  
Fresh blood     Gift from R.J.W. Heath, MGH, HMS
Nikon inverted microscope Nikon   Model Ti-E
Trapping laser, ChromaLase Blue Sky Research CLAS-106-STF02-02  
Fluorescence excitation laser Coherent   Model Innova 70C
Breadboards for trapping components Thorlabs MB1224, MB1218  
Optical air table Technical Manufacturing Corporation    
Electronic shutter with pedal control Uniblitz   Purchased from Vincent Associates, Rochester, NY
Singlemode optical fiber Oz Optics PMJ-3S3S-1064-6  
Fiber positioner Thorlabs PAF-X-5-C  
Fiber collimator Oz Optics HPUCO-23-1064-P-25AC  
Lenses for telescope Thorlabs AC254-150-B Focal length of 150 mm
Translation stages (x, y, z) Newport M-461-XYZ  
IR dichroic mirror Chroma ET750-sp-2p8  
Objective lens (100X) Nikon   NA = 1.49, oil immersion, TIRF objective
Confocal head Yokogawa CSU-XI  
Polarizer Nikon MEN51941  
Wollaston prism Nikon MBH76190  
EM-CCD camera Hamamatsu C9100-13  
CCD camera (ORCA ER) Hamamatsu C4742-80-12AG  
Filter wheel Ludl 99A353  
Filter wheel Sutter LB10-NWE  
Chambered coverglass Lab-Tek/Nunc 155409  
Dynabeads Invitrogen 111-51D Coated with anti-CD3
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) Invitrogen/Gibco 10313  
Penicillin/streptomycin Invitrogen/Gibco 15140-122  
L-glutamine Invitrogen/Gibco 25030-081  
Fetal Bovine Serum (HyClone) ThermoScientific SH30071.03  

References

  1. Grakoui, A. The immunological synapse: A molecular machine controlling T cell activation. Science. 285, 221-227 (1999).
  2. Monks, C. R. Three-dimensional segregation of supramolecular activation clusters in T cells. Nature. 395, 82-86 (1998).
  3. Stuart, L. M., Ezekowitz, R. A. Phagocytosis and comparative innate immunity: Learning on the fly. Nat Rev Immunol. 8, 131-141 (2008).
  4. Neuman, K. C., Block, S. M. Optical trapping. Rev Sci Instrum. 75, 2787-2809 (2004).
  5. Ashkin, A. Optical trapping and manipulation of neutral particles using lasers. Proc Natl Acad Sci USA. 94, 4853-4860 (1997).
  6. Ashkin, A. Acceleration and trapping of particles by radiation pressure. Phys Rev Lett. 24, 156-159 (1970).
  7. Ashkin, A., Dziedzic, J. Optical trapping and manipulation of viruses and bacteria Science. Nature. 235, 1517-1520 (1987).
  8. Khalil, A. S. Single M13 bacteriophage tethering and stretching. Proc Natl Acad Sci USA. 104, 4892-4897 (2007).
  9. Khalil, A. S. Kinesin’s cover-neck bundle folds forward to generate force. Proc Natl Acad Sci USA.. 105, 19247-19252 (2008).
  10. Li, Z. Membrane tether formation from outer hair cells with optical tweezers. Biophys J. , 1386-1395 (2002).
  11. Kim, S. The αβ T cell receptor is an anisotropic mechanosensor. J Biol Chem. 284, 31028-31028 (2009).
  12. Mohanty, S., Mohanty, K., Gupta, P. Dynamics of interaction of RBC with optical tweezers. Opt. Express. 13, 4745-4751 (2005).
  13. Tam, J. Control and manipulation of pathogens with an optical trap for live cell imaging of intercellular interactions. PLoS One. 5, e15215-e15215 (2010).
  14. Lin, S. J., Schranz, J., Teutsch, S. M. Aspergillosis case-fatality rate: Systematic review of the literature. Clin Infect Dis.. 32, 358-366 (2001).
  15. Wey, S. B. Hospital-acquired candidemia – the attributable mortality and excess length of stay. Arch. Intern. Med. 148, 2642-2645 (1988).

Play Video

Cite This Article
Tam, J. M., Castro, C. E., Heath, R. J. W., Mansour, M. K., Cardenas, M. L., Xavier, R. J., Lang, M. J., Vyas, J. M. Use of an Optical Trap for Study of Host-Pathogen Interactions for Dynamic Live Cell Imaging. J. Vis. Exp. (53), e3123, doi:10.3791/3123 (2011).

View Video