قياس الحمولة الجرثومية والاستجابات المناعية في الفئران المصابة المستوحدة الليستيريا</em
Summary
الليستريا المستوحدة هو كائن نموذج لدراسة الاستجابات المناعية والقابلية الوراثية لبكتيريا الخلايا في الفئران. هذه الطريقة تمكن واحد لقياس الحمولة الجرثومية وتولد وحيدة الخلية تعليق الكبد والطحال من الفئران لتحليل نظام مراقبة الأصول الميدانية لتحديد التغييرات في الخلايا المناعية بسبب عدوى الليستيريا.
Abstract
الليستريا المستوحدة (الليستريا) هو اختياري الممرض إيجابية الجرام الخلايا 1. دراسات الماوس توظف عادة الحقن في الوريد ليستيريا ، مما يؤدي في حالات العدوى النظامية 2. بعد الحقن ، والليستيريا تنشر بسرعة الى الكبد والطحال نتيجة لامتصاص الخلايا الجذعية CD8α + وخلايا كوبفر 3،4. phagocytosed مرة واحدة ، والبروتينات البكتيرية المختلفة تمكين الليستيريا للهروب من يبلوع ، البقاء داخل العصارة الخلوية ، وتصيب الخلايا المجاورة 5. خلال الأيام الثلاثة الأولى من العدوى ، ومختلف خلايا المناعة الفطرية (مثل الوحيدات ، العدلات ، والخلايا القاتلة الطبيعية ، والخلايا الجذعية) توسط الآليات التي تقلل من انتشار جراثيم الليستريا. CD8 + يتم تعيينهم في وقت لاحق ، والخلايا التائية المسؤولة عن إزالة الألغام في نهاية المطاف الليستيريا من المضيف ، وعادة في غضون 10 يوما من الإصابة 6.
التخليص الناجح ليستيريا من الفئران المصابة يتوقف على ظهور استجابات مناسبة المضيف المناعي 6. هناك طائفة واسعة من الحساسيات بين السلالات الفطرية 7،8 الماوس. عموما ، الفئران مع زيادة التعرض للعدوى الليستيريا هي أقل قدرة على السيطرة على انتشار الأسلحة الجرثومية ، مما يدل على زيادة الحمولة الجرثومية و / أو إزالة تأخر بالمقارنة مع الفئران المقاومة. وقد حددت الدراسات الجينية ، بما في ذلك تحليلات الربط وسلالات الفأر خروج المغلوب ، والجينات المختلفة التي تؤثر على تسلسل تباين ردود المضيفة للعدوى الليستيريا 6،8-14. تقرير ومقارنة بين حركية عدوى سلالات مختلفة الماوس وبالتالي وسيلة هامة لتحديد العوامل الوراثية المضيفة التي تسهم في الاستجابات المناعية ضد الليستيريا. المقارنة بين استجابات المضيف لسلالات مختلفة الليستيريا هو أيضا وسيلة فعالة لتحديد عوامل الفوعة الجرثومية التي قد تكون اهدافا محتملة للعلاج بالمضادات الحيوية أو تصميم لقاح.
نحن هنا وصف طريقة واضحة لقياس الحمولة الجرثومية (وحدات تشكيل مستعمرة [كفو] في النسيج) وإعداد وحيدة الخلية تعليق الكبد والطحال لتحليل FACS الاستجابات المناعية في الفئران المصابة الليستيريا. هذه الطريقة مفيدة بصفة خاصة لتوصيف الأولية للعدوى الليستيريا في سلالات الفأر الرواية ، وكذلك المقارنة بين الاستجابات المناعية بين سلالات مختلفة الماوس المصابين الليستيريا. نستخدم المستوحدة الليستيريا EGD السلالة ال 15 التي والمعارض عندما أغار على تربيتها في الدم ، وهي منطقة هالة مميزة حول كل مستعمرة بسبب انحلال الدم β – 1 (الشكل 1). ويمكن تحديد الحمولة الجرثومية والاستجابات المناعية عند أي نقطة في الوقت بعد الإصابة التي زراعة الأنسجة جناسة على لوحات أجار الدم وإعداد المعلقات خلية للتحليل الأنسجة FACS باستخدام البروتوكولات المذكورة أدناه. فإننا نلاحظ أن الأفراد الذين المناعة أو الحوامل يجب ألا تعامل الليستيريا ، وينبغي استشارة المؤسسية ذات الصلة بالسلامة الأحيائية لجنة إدارة المرافق والحيوان قبل بدء العمل.
Protocol
Discussion
Listeria is one of the most widely used organisms to characterize host immune responses to intracellular bacteria6. The protocol presented here enables one to measure bacterial load and immune cell responses within the same tissue of a given mouse. This dual measurement of a particular tissue for each infected mouse provides for more robust comparisons within and between mouse cohorts (either representing different mouse strains or time points post-infection). While Listeria infection by oral administration could also be used to study immune responses in mice, infection by intravenous injection is often used because: 1) it ensures rapid and effective delivery to the bloodstream; 2) it results in a synchronized and consistent systemic infection; and 3) the Mus species harbors a mutation in the gene encoding the E-cadherin receptor, which limits Listeria infection by oral administration (this mutation affects Listeria‘s ability to bind the mouse E-cadherin receptor and to efficiently cross the epithelial lining of the gastrointestinal tract)16-18.
There are a few critical steps in this protocol. First, the Listeria inoculum stock should be generated from a fresh overnight HBA culture to ensure viability and virulence. Second, it is important to accurately determine the CFU concentration of the inoculum before and after injecting all mice to ensure that the CFU concentration does not differ greatly between the first and last mouse injected. Third, injection of Listeria into the tail vein must be consistent for all mice. Lastly, it is necessary to perfuse the liver to deplete non-resident leukocytes to ensure accurate measurement of immune cells within the liver and not leukocytes passing through in the peripheral blood. All of these steps, if not performed successfully, can result in unwanted variability for bacterial load and/or immune responses between individual mice infected with Listeria.
Two limitations of this protocol are the investigator’s skill for infecting mice by intravenous injection and the detection of bacterial load in tissues. If one person is injecting a large number of mice, Listeria viability (i.e. CFU concentration) may reduce over time once the frozen inoculum is thawed (e.g. >2 hours between injecting first and last mouse). It is up to the investigator to determine how many mice she/he can inject before the inoculum is compromised. Another limitation of this method is that the Listeria load cannot be accurately measured below 100CFU/organ due to the relatively small amounts of cultured tissue homogenate (e.g. Figure 3 indicates that 100CFU/organ is the detection limit). To more accurately measure lower values for CFU/organ, a larger amount of the tissue homogenate can be cultured (up to 0.5mL per plate, multiple plates can be used) so a greater proportion of the tissue is sampled for detection of Listeria. If a Stomacher is not available, then alternative methods to homogenate the tissue, such as using a tissue homogenizer, can be used instead for steps 7.1-7.2. On a practical note, if space in the 37°C incubator is limited for culturing tissue samples from infected mice, then HBA culture plates can be incubated at room temperature for 2-3 days (the colonies will grow slower at room temperature). However, room temperature should not be used when growing cultures for preparation of frozen Listeria stocks.
This protocol provides a basic approach for characterizing Listeria infection in mice and can be used with other Listeria strains besides EGD. In addition to the liver and spleen, single-cell suspensions from lymph nodes can also be generated. In either instance, these single-cell suspensions can be used for a variety of analyses, including measuring immune cell subsets, and in vitro stimulation of sorted immune cells. Once the basic techniques are mastered this protocol can also be modified to isolate Listeria-specific T cells19, characterize dendritic cells20, or perform immune cell depletion at certain time-points after infection21,22 to more thoroughly characterize the immune response in mice infected with Listeria.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
فإن الكتاب أود أن أشكر آنا Walduck ، ابتهاج كريستينا ، برزينس ستيوارت ، جودفري ديل ، وزان ييفان Wilksch جوناثان للحصول على المشورة والكواشف. وقد تم تمويل هذا العمل من قبل مؤسسة ابحاث السكري لدى الصغار (1-2008-602) ومنظمة الصحة الوطنية الاسترالية ومجلس البحوث الطبية (575552). معتمد من قبل جائزة NW عليا الاسترالية. معتمد من قبل OW زمالة رايت RD من الصحة الوطنية الاسترالية مجلس البحوث الطبية.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
|---|---|---|---|
| Horse blood agar base No.2 | Oxoid | CM0271 | Preparation of agar base for HBA plates |
| Horse blood (defibrinated) | Oxoid | HB1000 | Add 5-10% to agar base |
| Brain heart infusion (BHI) broth (10 mL) | Oxoid | TM456 | |
| Brain heart infusion dehydrated media | Oxoid | CM1135 | |
| 96-well flat bottom plate | BD Biosciences | 353072 | |
| 70 μm cell strainer | BD Biosciences | 352350 | |
| Small petri dish | BD Biosciences | 351007 | |
| Stomacher 80 biomaster lab system | Seward | ||
| Plastic Stomacher bags | Sarstedt | 86 9924 530 | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A3912 | |
| FACS buffer | 0.1% (w/v) bovine serum albumin in PBS | ||
| Isotonic Percoll (33.75% Percoll in PBS) | GE Healthcare | 17-0891-01 | 33.75mL Percoll, 3.75mL 10x PBS, 62.5mL 1x PBS makes 100mL isotonic Percoll |
| TAC Buffer | 17mM Tris, 140mM ammonium chloride in distilled water | ||
| FCS/EDTA buffer | Fetal calf serum with 10mM EDTA | ||
| FACS/EDTA buffer | FACS buffer + 5mM EDTA | ||
| Trypan blue | Sigma | T6146 | 0.4% (w/v) in PBS, filter sterilized |
| 2mL Cryovial | Greiner Bio One | 121263 | |
| 27 gauge/1mL insulin syringe | Terumo Medical Products | SS10M2713 | |
| Needle | Terumo Medical Products | NN-2516R (25G 5/8in) NN-2613R (26G 1/2in) |
|
| Syringe | Terumo Medical Products | SS-01T (1mL), SS-053 (5mL), SS-10S (10mL) |
References
- Wing, E. J., Gregory, S. H. Listeria monocytogenes: clinical and experimental update. J Infect Dis. 185, S18-S24 (2002).
- Conlan, J. W. Early host-pathogen interactions in the liver and spleen during systemic murine listeriosis: an overview. Immunobiology. 201, 178-187 (1999).
- Neuenhahn, M., Busch, D. H. Unique functions of splenic CD8alpha+ dendritic cells during infection with intracellular pathogens. Immunol Lett. 114, 66-72 (2007).
- Cousens, L. P., Wing, E. J. Innate defenses in the liver during Listeria infection. Immunol Rev. 174, 150-159 (2000).
- Hamon, M., Bierne, H., Cossart, P. Listeria monocytogenes: a multifaceted model. Nat Rev Microbiol. 4, 423-434 (2006).
- Pamer, E. G. Immune responses to Listeria monocytogenes. Nat Rev Immunol. 4, 812-823 (2004).
- Cheers, C., McKenzie, I. F. Resistance and susceptibility of mice to bacterial infection: genetics of listeriosis. Infect Immun. 19, 755-762 (1978).
- Garifulin, O., Boyartchuk, V. Listeria monocytogenes as a probe of immune function. Brief Funct Genomic Proteomic. 4, 258-269 (2005).
- Gervais, F., Stevenson, M., Skamene, E. Genetic control of resistance to Listeria monocytogenes: regulation of leukocyte inflammatory responses by the Hc locus. J Immunol. 132, 2078-2083 (1984).
- Gervais, F., Desforges, C., Skamene, E. The C5-sufficient A/J congenic mouse strain. Inflammatory response and resistance to Listeria monocytogenes. J Immunol. 142, 2057-2060 (1989).
- Boyartchuk, V. L. Multigenic control of Listeria monocytogenes susceptibility in mice. Nat Genet. 27, 259-260 (2001).
- Boyartchuk, V. The host resistance locus sst1 controls innate immunity to Listeria monocytogenes infection in immunodeficient mice. J Immunol. 173, 5112-5120 (2004).
- Pan, H. Ipr1 gene mediates innate immunity to tuberculosis. Nature. 434, 767-772 (2005).
- Garifulin, O. Irf3 polymorphism alters induction of interferon beta in response to Listeria monocytogenes infection. PLoS Genet. 3, 1587-1597 (2007).
- Hof, H. Virulence of different strains of Listeria monocytogenes serovar 1/2a. Med Microbiol Immunol (Berl. 173, 207-218 (1984).
- Wollert, T. Extending the host range of Listeria monocytogenes by rational protein design. Cell. 129, 891-902 (2007).
- Lecuit, M. A transgenic model for listeriosis: role of internalin in crossing the intestinal barrier. Science. 292, 1722-1725 (2001).
- Marco, A. J. Penetration of Listeria monocytogenes in mice infected by the oral route. Microb Pathog. 23, 255-263 (1997).
- Busch, D. H., Vijh, S., Pamer, E. G. Animal model for infection with Listeria monocytogenes. Curr Protoc Immunol. Chapter. 19, 19-19 (2001).
- Neuenhahn, M., Schiemann, M., Busch, D. H. DCs in mouse models of intracellular bacterial infection. Methods Mol Biol. 595, 319-329 (2010).
- Conlan, J. W., North, R. J. Neutrophils are essential for early anti-Listeria defense in the liver, but not in the spleen or peritoneal cavity, as revealed by a granulocyte-depleting monoclonal antibody. J Exp Med. 179, 259-268 (1994).
- Czuprynski, C. J., Brown, J. F., Wagner, R. D., Steinberg, H. Administration of antigranulocyte monoclonal antibody RB6-8C5 prevents expression of acquired resistance to Listeria monocytogenes infection in previously immunized mice. Infect Immun. 62, 5161-5163 (1994).
