Entrega Gene eficiente em múltiplos territórios CNS Usando In Utero Eletroporação

A capacidade de manipular a expressão genética é a pedra angular da moderna embriologia experimental dias, levando para a elucidação de múltiplas vias de desenvolvimento. Vários poderosos e bem estabelecida tecnologias transgênicas estão disponíveis para manipular os níveis de expressão gênica no mouse, permitindo a geração de ambos os perda e ganho de função-modelos. No entanto, a geração de transgênicos do mouse é tanto caro e demorado. Métodos alternativos de manipulação genética, portanto, sido amplamente procurado. In utero eletroporação é um método de entrega de genes em embriões de ratos vivem ^1,2 que temos adaptado com sucesso ^3,4. É em grande parte baseada no sucesso de tecnologias na eletroporação in ovo que são comumente usados ​​em pinto ^5. Resumidamente, o DNA é injetado no ventrículos aberta do cérebro em desenvolvimento ea aplicação de uma corrente elétrica provoca a formação de poros transitórios na membrana celular, permitindo a absorção de DNA na célula. Em nossas mãos, os embriões podem ser eficientemente electroporated logo dia embrionário (E) 11,5, enquanto a segmentação de embriões mais jovens exigiria uma ultra-sonografia protocolo de microinjeção, como descrito anteriormente ^6. Por outro lado, E15.5 é a última fase, pode facilmente electroporate, devido ao aparecimento de parietal e diferenciação osso frontal, o que dificulta microinjeção no cérebro. Em contraste, a retina é acessível através do fim da embriogênese. Embriões podem ser coletados em nenhum momento durante o período embrionário ou pós-natal precoce. Injeção de uma construção repórter facilita a identificação de células transfectadas.

Até à data, em eletroporação utero tem sido mais utilizado para a análise do desenvolvimento neocortical ^1,2,3,4. Estudos mais recentes têm como alvo a retina embrionária ^7,8,9 e tálamo ^10,11,12. Aqui, apresentamos uma modificação no útero protocolo de eletroporação que pode ser facilmente adaptado a diferentes domínios alvo do SNC embrionárias. Nós fornecemos evidências de que usando esta técnica, podemos atingir o embrionárias telencéfalo diencéfalo e retina. Resultados representativos são apresentados, primeiro mostrando o uso desta técnica para introduzir DNA construções de expressão para os ventrículos laterais, o que nos permite monitorar a maturação de células progenitoras, diferenciação e migração no telencéfalo de embriões. Também mostramos que esta técnica pode ser usada para DNA-alvo para os territórios diencefálica em torno do 3 ^º ventrículo, permitindo que as rotas migratórias de diferenciar neurônios em núcleos diencefálica a ser monitorado. Finalmente, nós mostramos que o uso de micromanipuladores nos permite com precisão introduzir DNA construções em áreas-alvo de pequeno porte, incluindo o espaço sub-retiniano, permitindo-nos analisar os efeitos de manipular a expressão genética no desenvolvimento da retina.