פיתוח נייד מסוג ספציפי נגד HIV gp120 aptamers למסירה siRNA
Summary
מספר 2'-Fluoro aptamers נגד HIV-RNA 1Ba-L gp120 עם זיקה nanomole מבודדים מספריית RNA על ידי<em> במבחנה</em> הליך Selex. חדש כפול פונקציה מעכבות אנטי gp120 aptamer-siRNA הכימרה נוצר מראה הבטחה רבה לטיפול אנטי HIV מערכתית.
Abstract
מגפה עולמית של זיהום על ידי HIV יצרה צורך דחוף כיתות חדשות של סוכנים תרופתי. היכולת חזק של קטן (SI) RNAs התערבות כדי לבלום את הביטוי של תעתיקי רנ"א משלימים המנוצלת כמו סוג חדש של הרפוי עבור מגוון רחב של מחלות כולל איידס. דיווחים קודמים רבים הראו כי הרומן RNAi מבוסס anti-HIV/AIDS אסטרטגיות טיפוליות יש הבטחה רבה, עם זאת, מכשול מרכזי ליישום טיפולית מוצלחת תרגום הקליניים של siRNAs היא מסירה יעילה. במיוחד, בהתחשב הבטיחות והיעילות של RNAi מבוסס הרפוי, רצוי מאוד לפתח משלוח ממוקד תאיים siRNA הגישה אוכלוסיות תאים או רקמות ספציפיות. HIV-1 gp120 חלבון, מעטפה גליקופרוטאין על פני השטח של HIV-1, ממלא תפקיד חשוב בכניסה ויראלי לתאי CD4. האינטראקציה של gp120 ו CD4 שמפעיל HIV-1 כניסה יוזם היתוך תא יאומת כאסטרטגיה אנטי ויראלית רלוונטיות קלינית לגילוי סמים.
בזאת, אנחנו קודם כל לדון הבחירה וזיהוי של 2'-F שונה אנטי HIV aptamers gp120-RNA. בשיטה הקונבנציונלית nitrocellulose לסנן Selex, aptamers חדש מספר עם זיקה nanomolar בודדו מתוך 50 מקרי NT-RNA הספרייה. על מנת להשיג בהצלחה המינים קשורים עם זיקה גבוהה יותר, חומרא הבחירה נשלטת בקפידה על ידי התאמת התנאים. Aptamers שנבחרו במיוחד יכולים להיקשר ולהיות הפנימו במהירות לתוך תאים המבטאים את חלבון ה-HIV-1 המעטפה. בנוסף, aptamers לבדו יכול לנטרל HIV-1 infectivity. בהתבסס על aptamer מיטב A-1, יש לנו גם ליצור רומן כפול פונקציה מעכבות אנטי gp120 aptamer-siRNA הכימרה שבו הן aptamer ואת מנות siRNA יש עוצמה אנטי HIV פעילויות. יתר על כן, אנו מנצלים את gp120 aptamer-siRNA מפלצות למסירה התא סוג מסוים של siRNA לתוך HIV-1 תאים נגועים. זה תפקיד כפול הכימרה מראה פוטנציאל רב לשילוב שונים סוכני חומצות גרעין טיפולית (aptamer ו siRNA) ב-HIV-1 דיכוי, מה שהופך את aptamer-siRNA מפלצות מועמדים אטרקטיביים טיפולית לחולים באי טיפול תרופתי פעיל מאוד (HAART).
Protocol
Discussion
Aptamers הן במבחנה התפתח חומצות גרעין להניח כי ספציפיים יציב צורות תלת ממדיות, ובכך לספק מאוד ספציפיות, וכפותים מולקולות ממוקדות 8. הזיקה נמוך מחייב nanomolar וספציפיות מעודן של aptamers אל המטרות שלהם להפוך אותם כלים תכליתי עבור אבחון, in vivo הדמיה ותרופות 9. ע…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים בריטה Hoehn, Guihua Sun, האריס Soifer וליסה שרר לדיונים מועילים. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהמוסד הלאומי לבריאות AI29329 ו HL07470 הוענק JJR ריאגנטים הבאים התקבלו באמצעות האיידס NIH מחקר מגיב תוכנית הפניה, אגף איידס, NIAID, NIH: CHO CHO-EE ו-gp160 תא קו; pNL4-3 לוק וקטור; HIV-1 באל gp120 מ DAIDS, NIAID.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| MF-Millipore membrane filter | Millipore | HAWP01300 | Pore size 0.45 μm |
| Swinnex Filter holder | Millipore | SX0001300 | 13 mm diameter |
| QIAquick Gel Extraction Kit | QIAGEN | 28706 | DNA purification |
| Microcon YM-30 column | Millipore | 42410 | RNA concentration |
| Bio-spin 30 column | Bio-Rad | 732-6250 | RNA purification |
| Taq PCR DNA polymerase | Sigma-Aldrich | D1806 | |
| ThermoScript RT-PCR system | Invitrogen | 11146-024 | |
| DuraScribe T7 transcription Kit | EpiCentre | DS010925 | |
| dNTP for PCR | Roche | 1 581 295 | |
| Ribonucleic acid, transfer from E.coli | Sigma-Aldrich | R1753 | tRNA competitor |
| HIV-1Ba-L gp120 protein | the AIDS Research and Reference Reagent Program | 4961 | Target protein |
| Silencer siRNA labeling kit – Cy3 | Ambion | 1632 | |
| Acid phenol/chloroform 5/1 solution (pH 4.5) | Ambion | AM9720 | |
| Chloroform/Isopropanol 24/1 solution | Sigma | C0549 | |
| Calf intestinal phosphatase (CIP) | New England BioLab | M0290L | |
| T4 polynucleotide kinase | New England BioLab | M0201L | |
| Glycogen | Roche | 10 901 393 001 | RNA precipitation |
| Gamma-P32-ATP | MP Biomedical | 013502002 | Radiactivity |
| 40% AccuGel 19:1 | National Diagnostics | EC-850 | |
| 10xTBE | National Diagnostics | EC-860 | |
| N,N,N,N’-Tetramethylethylenediamine (TMEMD) | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| Ammonium persulfate (APS) | Sigma-Aldrich | A3678 | |
| L-methioine sulfoximine | Sigma-Aldrich | M5379-250 mg | |
| RPMI Media 1640 | Invitrogen | 11835-030 | |
| Sodium Bicarbonate solution, 7.5% w/v | Invitrogen | 25080-094 | |
| Minimum Essential Medium (MEM) (10) | Invitrogen | 11430-030 | |
| MEM non-essential amino acid (100) | Invitrogen | 11140-050 | |
| TA cloning kit with pCR 2.1 | Invitrogen | K2040-01 |
References
- Tuerk, C., Gold, L. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase. Science. 249, 505-510 (1990).
- Ellington, A. D., Szostak, J. W. In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands. Nature. 346, 818-822 (1990).
- Robertson, D. L., Joyce, G. F. Selection in vitro of an RNA enzyme that specifically cleaves single-stranded DNA. Nature. 344, 467-468 (1990).
- Fitzwater, T., Polisky, B. A SELEX primer. Methods Enzymol. 267, 275-301 (1996).
- Weiss, C. D., White, J. M. Characterization of stable Chinese hamster ovary cells expressing wild-type, secreted, and glycosylphosphatidylinositol-anchored human immunodeficiency virus type 1 envelope glycoprotein. J Virol. 67, 7060-706 (1993).
- Vodicka, M. A. Indicator cell lines for detection of primary strains of human and simian immunodeficiency viruses. Virology. 233, 193-198> (1997).
- Zhou, J. Selection, characterization and application of new RNA HIV gp 120 aptamers for facile delivery of Dicer substrate siRNAs into HIV infected cells. Nucleic Acids Res. , (2009).
- Mayer, G. The chemical biology of aptamers. Angew Chem Int Ed Engl. 48, 2672-2689 (2009).
- Famulok, M., Hartig, J. S., Mayer, G. Functional aptamers and aptazymes in biotechnology, diagnostics, and therapy. Chem Rev. 107, 3715-3743 (2007).
- Chu, T. C., Twu, K. Y., Ellington, A. D., Levy, M. Aptamer mediated siRNA delivery. Nucleic Acids Res. 34, e73-e73 (2006).
- McNamara, J. O., 2nd, . Cell type-specific delivery of siRNAs with aptamer-siRNA chimeras. Nat Biotechnol. 24, 1005-1015 (2006).
- Dassie, J. P. Systemic administration of optimized aptamer-siRNA chimeras promotes regression of PSMA-expressing tumors. Nat Biotechnol. 27, 839-849 (2009).
- Zhou, J., Rossi, J. J. The therapeutic potential of cell-internalizing aptamers. Curr Top Med Chem. 9, 1144-1157 (2009).
- Zhou, J., Li, H., Li, S., Zaia, J., Rossi, J. J. Novel dual inhibitory function aptamer-siRNA delivery system for HIV-1 therapy. Mol Ther. 16, 1481-1489 (2008).
