تطوير خلية من نوع معين الأبتامرات gp120 المضادة لفيروس الإيدز لتسليم سيرنا
Summary
يتم عزل عدة 2' – RNA الفلوري الأبتامرات ضد فيروس نقص المناعة البشرية 1Ba – L gp120 مع تقارب nanomole من مكتبة بواسطة الحمض النووي الريبي<em> في المختبر</em> سيليكس الداخلي. يتم إنشاء وظيفة جديدة مزدوجة المثبطة المضادة للgp120 aptamer – سيرنا الوهم ويبين الوعد كبيرة للعلاج المضاد لفيروس نقص المناعة البشرية الشاملة.
Abstract
وقد خلق هذا الوباء العالمي للعدوى بفيروس نقص المناعة البشرية حاجة ملحة لفئات جديدة من وكلاء المضادة للفيروسات. ويجري استغلال قدرة قوية من الرناوات الصغيرة (SI) بالتدخل لمنع التعبير عن النصوص الحمض النووي الريبي باعتبارها مكملة فئة جديدة من العلاجات لمجموعة متنوعة من الأمراض بما فيها فيروس نقص المناعة البشرية. وقد أظهرت العديد من التقارير السابقة أن رواية [رني مكافحة الإيدز المستندة إلى استراتيجيات علاجية واعدة كبيرة ، ومع ذلك ، يشكل عقبة رئيسية لتطبيق العلاجية الناجحة والترجمة السريرية لsiRNAs هو تسليم كفاءة. خصوصا ، نظرا لسلامة وفعالية العلاجات المستندة إلى رني ، فمن المرغوب فيه جدا لتطوير استهدفت تسليم سيرنا داخل الخلايا نهج للسكان خلية معينة أو الأنسجة. في HIV – 1 gp120 البروتين ، بروتين سكري مغلف على سطح HIV – 1 ، ويلعب دورا هاما في دخول الفيروس الى خلايا CD4. وقد تم التحقق من صحة تفاعل gp120 CD4 والذي يقوم بتشغيل HIV – 1 دخول الخلية ويبدأ الانصهار بوصفها استراتيجية مضادة للفيروسات ذات الصلة سريريا لاكتشاف المخدرات.
هنا ، نحن نناقش أولا اختيار وتحديد 2' – F معدلة لمكافحة فيروس نقص المناعة البشرية الأبتامرات RNA gp120. باستخدام أسلوب التصفية النيتروسليلوز سيليكس التقليدية ، وقد تم عزل عدة الأبتامرات جديدة مع تقارب nanomolar من 50 عشوائي مكتبة RNA NT. من أجل الحصول على الأنواع بنجاح ملزمة مع ارتفاع تقارب ، ويتم التحكم بعناية في اختيار التشدد من خلال تعديل الشروط. يمكن ربط الأبتامرات مختارة خصيصا ويكون استوعب بسرعة إلى الخلايا التعبير عن بروتين HIV – 1 المغلف. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن للالأبتامرات وحده تحييد عدوى HIV – 1. استنادا إلى أفضل aptamer A – 1 ، ونحن أيضا إنشاء وظيفة مزدوجة المثبطة المضادة للرواية gp120 aptamer – سيرنا في الوهم الذي aptamer كلا من والأجزاء سيرنا وفعالة لمكافحة فيروس نقص المناعة البشرية الأنشطة. كذلك ، ونحن الاستفادة من gp120 aptamer – سيرنا الوهم لخلية من نوع التسليم المحددة للسيرنا داخل الخلايا المصابة HIV – 1. هذه الوظيفة المزدوجة خيمر يظهر إمكانات كبيرة للجمع بين مختلف وكلاء الحمض النووي العلاجية (aptamer وسيرنا) في عدوى HIV – 1 قمع ، مما يجعل من الوهم aptamer – سيرنا المرشحين العلاجية لمرضى الفشل جذابة العلاج المضاد للفيروسات نشطة للغاية (HAART).
Protocol
Discussion
الأبتامرات هي في المختبر تطورت الأحماض النووية التي تفترض محددة ومستقرة الأشكال ثلاثية الأبعاد ، مما يوفر للغاية محددة وملزمة لضيق الجزيئات المستهدفة 8. انخفاض تقارب ملزم nanomolar ونوعية رائعة من الأبتامرات إلى أهدافهم جعلها أدوات متعددة للتشخيص والتصوير <em…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر بريتا Hoehn ، أحد Guihua ، Soifer هاريس وليزا شيرر لإجراء مناقشات مفيدة. وأيد هذا العمل من المنح المقدمة من المعاهد الوطنية للصحة وAI29329 HL07470 منحت لJJR والكواشف التالية تم الحصول عليها من خلال أبحاث الإيدز والمعاهد الوطنية للصحة مرجع برنامج الكاشف ، شعبة الإيدز ، NIAID ، المعاهد الوطنية للصحة : إن تشو تشو والخلية EE – gp160 خط ، وpNL4 – 3 ناقلات لوك ؛ بال HIV – 1 من gp120 DAIDS ، NIAID.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| MF-Millipore membrane filter | Millipore | HAWP01300 | Pore size 0.45 μm |
| Swinnex Filter holder | Millipore | SX0001300 | 13 mm diameter |
| QIAquick Gel Extraction Kit | QIAGEN | 28706 | DNA purification |
| Microcon YM-30 column | Millipore | 42410 | RNA concentration |
| Bio-spin 30 column | Bio-Rad | 732-6250 | RNA purification |
| Taq PCR DNA polymerase | Sigma-Aldrich | D1806 | |
| ThermoScript RT-PCR system | Invitrogen | 11146-024 | |
| DuraScribe T7 transcription Kit | EpiCentre | DS010925 | |
| dNTP for PCR | Roche | 1 581 295 | |
| Ribonucleic acid, transfer from E.coli | Sigma-Aldrich | R1753 | tRNA competitor |
| HIV-1Ba-L gp120 protein | the AIDS Research and Reference Reagent Program | 4961 | Target protein |
| Silencer siRNA labeling kit – Cy3 | Ambion | 1632 | |
| Acid phenol/chloroform 5/1 solution (pH 4.5) | Ambion | AM9720 | |
| Chloroform/Isopropanol 24/1 solution | Sigma | C0549 | |
| Calf intestinal phosphatase (CIP) | New England BioLab | M0290L | |
| T4 polynucleotide kinase | New England BioLab | M0201L | |
| Glycogen | Roche | 10 901 393 001 | RNA precipitation |
| Gamma-P32-ATP | MP Biomedical | 013502002 | Radiactivity |
| 40% AccuGel 19:1 | National Diagnostics | EC-850 | |
| 10xTBE | National Diagnostics | EC-860 | |
| N,N,N,N’-Tetramethylethylenediamine (TMEMD) | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| Ammonium persulfate (APS) | Sigma-Aldrich | A3678 | |
| L-methioine sulfoximine | Sigma-Aldrich | M5379-250 mg | |
| RPMI Media 1640 | Invitrogen | 11835-030 | |
| Sodium Bicarbonate solution, 7.5% w/v | Invitrogen | 25080-094 | |
| Minimum Essential Medium (MEM) (10) | Invitrogen | 11430-030 | |
| MEM non-essential amino acid (100) | Invitrogen | 11140-050 | |
| TA cloning kit with pCR 2.1 | Invitrogen | K2040-01 |
References
- Tuerk, C., Gold, L. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase. Science. 249, 505-510 (1990).
- Ellington, A. D., Szostak, J. W. In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands. Nature. 346, 818-822 (1990).
- Robertson, D. L., Joyce, G. F. Selection in vitro of an RNA enzyme that specifically cleaves single-stranded DNA. Nature. 344, 467-468 (1990).
- Fitzwater, T., Polisky, B. A SELEX primer. Methods Enzymol. 267, 275-301 (1996).
- Weiss, C. D., White, J. M. Characterization of stable Chinese hamster ovary cells expressing wild-type, secreted, and glycosylphosphatidylinositol-anchored human immunodeficiency virus type 1 envelope glycoprotein. J Virol. 67, 7060-706 (1993).
- Vodicka, M. A. Indicator cell lines for detection of primary strains of human and simian immunodeficiency viruses. Virology. 233, 193-198> (1997).
- Zhou, J. Selection, characterization and application of new RNA HIV gp 120 aptamers for facile delivery of Dicer substrate siRNAs into HIV infected cells. Nucleic Acids Res. , (2009).
- Mayer, G. The chemical biology of aptamers. Angew Chem Int Ed Engl. 48, 2672-2689 (2009).
- Famulok, M., Hartig, J. S., Mayer, G. Functional aptamers and aptazymes in biotechnology, diagnostics, and therapy. Chem Rev. 107, 3715-3743 (2007).
- Chu, T. C., Twu, K. Y., Ellington, A. D., Levy, M. Aptamer mediated siRNA delivery. Nucleic Acids Res. 34, e73-e73 (2006).
- McNamara, J. O., 2nd, . Cell type-specific delivery of siRNAs with aptamer-siRNA chimeras. Nat Biotechnol. 24, 1005-1015 (2006).
- Dassie, J. P. Systemic administration of optimized aptamer-siRNA chimeras promotes regression of PSMA-expressing tumors. Nat Biotechnol. 27, 839-849 (2009).
- Zhou, J., Rossi, J. J. The therapeutic potential of cell-internalizing aptamers. Curr Top Med Chem. 9, 1144-1157 (2009).
- Zhou, J., Li, H., Li, S., Zaia, J., Rossi, J. J. Novel dual inhibitory function aptamer-siRNA delivery system for HIV-1 therapy. Mol Ther. 16, 1481-1489 (2008).
