GABA-aktivierten Single-Channel-und Tonic Currents in Hirnschnitten der Ratte

1. Vorbereitung von Hirnschnitten: 22 Tage alte Wistar-Ratten – Experimente auf hippocampalen Hirnschnitten aus postnatalen 16 vorgenommen. Die Tiere sind durch Enthauptung in Übereinstimmung mit den örtlichen ethischen Richtlinien und genehmigt Tierpflege Protokolle geopfert. Schnelles Entfernen des Gehirns mit einem Spatel und schneiden Sie ihn entlang der Mittellinie mit einem Skalpell (# 24). Platzieren Sie jede Halbkugel auf einem Whatman Filterpapier mit dem Schnitt vor dem Papier. Setzen Sie einen Tropfen Sekundenkleber auf die Probe Festplatte und Ort der Hemisphäre auf der sie mit der Schnittfläche nach unten. Das Objekt Datenträger in den Mahlraum der Vibratom, die mit einem eiskalten künstlichen Liquor gefüllt ist (ACSF finden Sie hier unter 3,1). Stellen Sie die Schichtdicke bis 400 uM und fang an zu schneiden das Gehirn. Sie müssen abgeschnitten ca. 2 mm von Hirngewebe, bevor Sie den Hippocampus zu erreichen. Der Hippocampus Scheiben in ein Glas Petrischale mit ACSF gefüllt setzen. Die Platte wird auf einem schwarzen Hintergrund (zB schwarzes Papier) platziert, um eine einfache Visualisierung der hippocampi zu ermöglichen. Isolieren der Hippocampus aus dem umgebenden Gewebe mit scharfen chirurgischen Klingen. Achten Sie darauf, Push-oder Pull das Gewebe. Scheiben werden dann in der ACSF Lösung bei 37,0 ° C für 1 Stunde und dann bei Raumtemperatur gelagert werden, bis Experimente durchgeführt inkubiert. Während der einstündigen Inkubation des Gewebes erholt sich von den Schäden, die durch den Schneidvorgang verhängt. 2. Vorbereitung von Pipetten für das Patchen: Pipetten sind aus Borosilikatglas Kapillaren aus. Der Patch-Pipetten sind auf einem automatischen oder manuellen Pipetten-Puller was Pipetten gezogen Widerstand von 2 bis 4 MOhm für die gesamte Zelle Aufnahmen oder 8 bis 20 MOhm für Einzel-Kanal-Aufnahmen, wenn mit dem entsprechenden Pipettenlösung und das Bad Lösung das ACSF gefüllt (siehe unten, 3.1). Die Pipetten verwenden wir für einkanalige Aufnahmen sind poliert mit einem microforge, wo die Wärme aus einem geschmolzenen Glas sitzen auf dem Platindraht macht die Oberfläche glatter. Das gleiche Borosilikatglas wie in der Patch-Pipetten wird verwendet, um das Glas Tropfen auf den Draht zu bilden. Polieren der Pipetten auf diese Weise in unserer Erfahrung schafft Pipetten, stabiler und höherer Widerstand Dichtungen Form zu Pipetten durch die Hitze von einem unbeschichteten Draht oder durch einen Polier Schritt in der automatisierten puller poliert verglichen. Die endgültige Größe der Pipetten reicht von 8 bis 20 MOhm. Pipetten in Ganzzellableitungen verwendet werden, nicht poliert. 3. Lösungen in den Experimenten verwendet: Spezifische Lösungen sind für den Single-Channel-und whole-cell-Aufnahmen genutzt. ACSF enthält in mM: 124 NaCl, 26 NaHCO 3, 3 KCl, 1,3 MgSO 4, 2,5 Na 2 HPO 4, 2,5 CaCl 2, 10 Glucose mit pH 7,2 bis 7,4, wenn sie mit 95% O 2 und 5% CO 2 geleitet. Die ACSF wird manchmal auch mit anderen Nährstoffen wie zB Laktat 11 ergänzt. Einzel-Kanal-Aufnahmen: Die Badlösung ist entweder ACSF oder in mM: 140 NaCl, 5 KCl, 1 MgCl 2, 1,8 CaCl 2 und 10 TES (N-Tris [hydroxymethyl] methyl-2-Aminoethansulfonsäure) pH 7,25 und anderen Drogen Das mag für die spezifische Experimente benötigt werden Die Pipette Lösung für Zell-attached und inside-out-Patches in mM:. 140 Cholin Cl, 5 NaCl, 1 KCl, 1 MgCl 2, 1,8 CaCl 2, 10 TES pH 7,25, 200 uM saclofen (GABAB Antagonist) und 0 bis 1 uM GABA. Für Außen-out-Patches in mM: 140 NaCl oder Cholin Cl, 0,3 KCl, 2 MgCl 2, 0,5 CaCl 2, 5 EGTA, 10 TES pH 7,2 bis 7,4. Whole-cell Voltage-Clamp-Aufnahmen: Die Badlösung:. Slices sind perfundiert (2-3 ml / min) mit ACSF jetzt mit auch Kynurensäure (3 mm) und andere Medikamente, die für die spezifische Experimente benötigt werden Die Pipette Lösung enthält in mm: 140 CsCl, 1 CaCl 2, 3 EGTA, 0,5 KCl, 1 MgCl 2, 2 ATP-Mg, 0,3 GTP-Na, 5 QX-314 Bromid, 10 TES pH-Wert von 7,25 mit CsOH. 4. Bilden eines Giga Ohm (&OHgr;) Dichtung für Patch-Clamp-Experimente: Der Hippocampus Hirnschnitten (Abb. 1A) werden am unteren Rand der Aufnahme Kammer an Nylonfäden an einem U-förmigen Platindraht statt. Um das Gewebe Organisation zB der CA1 und 3 und der Gyrus dentatus Region im Hippocampus Scheiben oder die spezifischen Zellen sichtbar zu machen, benötigen Sie ein Mikroskop. Die meisten Labors nutzen ein aufrechtes Mikroskop mit Objektiven von 10X bis 60X so dass man Regionen oder bestimmte Zellen in das Gewebe zu identifizieren. Doch für das Patchen Scheiben sogar ein Dissektionsmikroskop verwendet werden kann und dann visuell zu identifizieren einer Region zu patchen, aber nicht einer bestimmten Zelle. Diese Art von Patches ist "blind Patching" bezeichnet. Ichn beiden Fällen am Ende ist das Patchen einer einzelnen Zelle in einem bestimmten Bereich. Die Erfolgsquote ist ähnlich für die beiden Methoden. Obwohl die Zellkörper der wichtigsten Zellen im Hippocampus in stark strukturierten Lamina (zB CA3/CA1 Stratum pyramidale und identifiziert als hellen Streifen in der hippocampalen Hirnschnitt) unter allen Unterfelder und Schichten des Hippocampus verstreut sind organisiert sind die Zellkörper der hemmenden Interneuronen, aus denen sich etwa 10% des gesamten neuronalen Population 12. Die gelegentliche Interneuron oder Gliazellen, die in den Körnerzellen oder pyramidenförmige Nervenzellen Lamina gepatcht werden kann, kann von den wichtigsten Zellen durch die unterschiedlichen elektrischen Eigenschaften dieser Zellen (siehe Der Hippocampus Book 13) unterschieden werden. GOhm Dichtung Bildung. Während dieser Prozedur der Glaspipette irgendwie wird eng an der Zellmembran befestigt und in den verschiedenen Patch-Konfigurationen (siehe unten, 4 und 5) können wir die Aktivität des GABA-aktivierten Kanäle in der Zellmembran sind zu messen. Setzen Sie die Pipette in die Pipettenhalter und ziehen Sie die Kappe, die Pipette befestigt. Einstellungen auf der Axoclamp Verstärker 200B sind: V-Klemme, Gain 2, Filter 2 kHz, ist die Holding-Potential 0 mV und wir tun das Experiment über den Computer mit dem PClamp Software. Schlag in das Mundstück, das die Röhre, die den Pipettenhalter verbindet und schließen Sie das Ventil zwischen dem Mundstück und dem Rohr befestigt wird. Das schafft positive Druck in Ihrer Pipette. Der Überdruck in der Pipette hat zwei Funktionen: Zunächst wird ein Strom kommt aus der Pipette und einmal die Pipette in die Badlösung es helfen, halten die Pipettenspitze sauber wird. Zweitens, die Anwendung einer sanften Sog der Zellmembran durch die Patch-Pipette ist ein wichtiger Teil der Bildung einer hohen Qualität, mit hohem Widerstand zu versiegeln. Die Dichtung kann oft nur durch Öffnen des Ventils, dass die Pipette Druckschalter gebildet werden. Aus diesem Grund stellen Sie sicher, es gibt keine Leckagen. Sie können ganz einfach auf Dichtigkeit testen, indem Sie die Halterung mit der Pipette, taucht es in ein Becherglas mit Wasser und blasen in das Mundstück gefüllt. Wenn Sie sehen, alle Luftblasen entweichen dann, dass ein Teil ist nicht fest genug. Senken Sie Ihre Pipette in die Badlösung. Auf dem Computer-Bildschirm, wo Sie messen die Pipette Widerstand sehen Sie ein Rechteckimpuls von einem 5 mV Impulsfolge und eine Nummer, die Ihnen sagt, der Widerstand der Pipette erzeugt. Kleinere Zahl steht für größere Pipettenspitze Öffnungen, größere Pipetten. Passen Sie die Pipette Offset auf 0 gesetzt. Abdichtung an der Zellmembran. Identifizieren Sie die Region oder die Zelle, die Sie zu patchen gehen, dass Form ist ein Siegel auf. Im Hirnschnitt kann man erkennen Gyrus dentatus Granulat oder der CA1 und CA3 Pyramidenzellen Körperregionen des Hippocampus als hellen Streifen (siehe Abb.. 1A) mit dem 10-facher Vergrößerung unter dem Mikroskop oder wir können die einzelnen Oberfläche Pyramidenneuronen identifizieren mit dem 60-fache Vergrößerung. Bringen Sie Ihre Pipette in den Fokus, so dass Sie sowohl Ihre Region / Zelle und die Pipette, wenn Sie durch das Mikroskop Okulare schauen. Platzieren Sie die Pipette über der Mitte der Region / Zelle mit dem Grob-Bewegung Manipulator Einstellungen und senken Sie die Pipette, bis es gerade oben, aber nicht berühren das Gewebe. Sehr sanft senken Sie Ihre Pipette auf die Mitte Ihrer Region / Zelle mit der Fein-Bewegung-Einstellungen auf Ihrem Manipulator und zur gleichen Zeit beobachten die Computer-Bildschirm und verfolgen Sie Ihre Pipette Widerstand. Keep moving Ihrer Pipette nach unten, bis Sie den Widerstand der Pipette immer größer (nach oben) zu sehen. Nun, sanft Release der Überdruck in der Pipette durch Öffnen des Ventils. Dies läuft auf eine sanfte Saugwirkung und oft ein giga-Dichtung (hohe Dichtung, GOhm) bildet automatically.If nicht, dann abgesaugt, um das Mundstück, wo Sie bisher angewandten positiven Druck und die Giga-Seal bilden. Sie haben nun die sogenannte Cell-angehängter Patch-Clamp-Konfiguration (siehe Abb.. 1B) erhalten. Passen Sie die schnellen und langsamen Kapazität Entschädigung an den Transienten aus der Pipette und der Pipettenhalter abzubrechen. Auf dem Computer-Bildschirm sehen Sie nun eine flache aktuellen Spur. Je höher die GOhm Dichtung Wert ist, desto besseres Signal-Rausch-Verhältnis werden Sie in den Single-Channel-Aufnahmen haben. Es kann manchmal von Vorteil sein, Patch innerhalb des Hippocampus in Scheiben schneiden. In einigen Fällen können die Zellen werden gesünder, wenn sie nicht auf der Oberfläche, da sie mehr geschützt sind. Auch im Falle man die Untersuchung der Auswirkungen der extrazellulären Umgebung auf zelluläre Funktionen, wie z. B. Wirkung von extrazellulären GABA-Konzentrationen auf tonic aktuellen Generation in Neuronen, Patchen im Gewebe kann ein Vorteil sein. Das Patchen Verfahren ist das gleiche wie oben außer, dass man beschriebenen entbindet den positive Druck in der Pipette, bis die Pipettenspitze innerhalb der Schicht. 5. Gründung der whole-cell-Konfiguration und Aufzeichnung whole-cell Ströme: In der Zelle-Attach-Konfiguration, ändern Sie die Pipette Potential auf -60 mV oder in der Nähe des Ruhemembranpotential der Zelle. Unterdruck anwenden, um die Pipette über die Röhre, die den Pipettenhalter verbunden ist und zur gleichen Zeit sehen dem Bildschirm, um die Änderung des Widerstandes und der Kapazität Transienten, sobald Sie in die Zelle gebrochen zu haben scheinen beachten. Wenn dies passiert, werden in der so genannten Whole-Cell-Konfiguration oder Whole-Cell-Modus (Abb. 1B). Die Zellmembran Widerstand variiert von einer Zell-Typ in einen anderen und hängt von der Leitfähigkeit der Kanäle in der Membran und wie viele offen sind. Die Zellmembran Kapazität variiert mit der Größe der Zelle. Saug sollte zunächst vorsichtig sein, aber wenn es schwierig ist, in die Zelle mehr Kraft zu brechen angewendet werden können. Impulse von Saug können ebenfalls verwendet werden. Manchmal ist eine Entschädigung für den Widerstand, der zwischen der Pipette und der Zelle entwickelt erforderlich ist. Dies ist Serie oder den Zugang (Rs oder Ra) Kompensation genannt und kann entweder über die Software oder manuell über einen Drehknopf am Verstärker vorgenommen werden. In unseren Experimenten haben wir nicht für Ra kompensieren, sondern Experimente werden abgelehnt, wenn es um mehr als 25% variiert von den ersten Zugriff Widerstand. GABA-aktivierten Tonic Strömungen in der whole-cell-Modus aufgenommen. In der whole-cell-Konfiguration in hippocampalen CA1 pyramidalen Neuronen setzen wir die Holding Potential bei – 60 mV und warten 5 – 10 Minuten ermöglicht die Pipette Lösung mit dem Zellinnern ins Gleichgewicht. Während dieser Zeit die Aufnahme stabil wird. Während des Experiments verfolgen wir den Wert der Serienwiderstand. Die Experimente werden in Voltage-Clamp getan und messen Sie den Strom durch eine Population von Kanälen in der whole-cell-Membran. Man kann zwischen GABA-aktivierten synaptischen und extrasynaptische Ströme durch die phasische und tonische Charakter der Strömungen zu unterscheiden. Der Antagonist SR95531 hemmt alle GABA A Ströme. Der Rückgang in der Haltestrom zeigt den Pegel des GABA-aktivierten Tonic Strom in das Neuron. Wie wir in der Tonika GABA-aktivierte Strom, der abhängig von der extrazellulären, ambient GABA ist in der Scheibe interessiert sind, die wir normalerweise nicht patch die Zellen auf der Oberfläche, sondern die Zellen innerhalb der Schicht. Agonisten und Antagonisten, die wir verwenden zur Modulation des GABA A-Kanäle in der Badlösung appliziert werden und die Zellen innerhalb der Schicht zu erreichen. Die Rate der Lösung fließen in die experimentelle Kammer 2 bis 3 ml / min. 6. Recording Einkanal-Ströme: Die Experimente werden in der Zelle-attached, die inside-out oder outside-out Patch-Clamp-Konfiguration durchgeführt (siehe hier unten), und wir erfassen Ströme durch Single-Channel-Moleküle, die Single-Channel-Ströme. Einstellungen auf Axoclamp 200B, V-Klemme, gewinnen 500, Filter 2 oder 5 kHz. Mit dem PClamp Software, die wir der Pipette Potenzial Steuerelement die Abtastrate auf nicht weniger als 100 ms und notieren Sie die Ströme. Um Lärm in Einzel-Kanal-Aufnahmen minimieren das Volumen der Badlösung wird niedrig gehalten, so dass es deckt nur die Scheibe. GABA-aktivierten Kanäle in der Cell-Attached-Konfiguration. Wenn Sie eine GOhm Siegel auf der Membran sind Sie in der Zelle-Attached-Modus erhalten, und Sie können aus den Kanälen, die in der Membran-Patch von der Pipette eingeschlossen sind Rekord (siehe Abb.. 1B). Da GABA nicht überquert die Zellmembran, wird GABA in die Pipette Lösung zu bringen, um die Kanäle in den Patch zu aktivieren. Extrasynaptische GABA-aktivierten Kanäle aktivieren mit einer Latenzzeit von bis zu wenigen Minuten. Der Patch Potenzial ist = – Pipette Potenzial dh wenn in PClamp Sie das Potential gesetzt bei – 40 mV, wird es durch die Membran als depolarisiert 40 mV aufgezeichnet. Der Vorteil der Aufnahme in die Zelle-Attached-Modus ist, dass der Kanal in seiner natürlichen Umgebung ist und im Zusammenhang mit der normalen intrazellulären Proteinen und Faktoren. Der Nachteil ist, dass man nicht genau, welches Potenzial Sie aufzeichnen wissen, wie Sie nicht wissen, die absolute Ruhemembranpotential und das Potential über den Patch wird sowohl durch die Pipette Potenzial und das Ruhemembranpotential der Zelle bestimmt. GABA-aktivierten Kanäle in der Inside-Out-Konfiguration. Wenn in der Zelle-Attached-Modus heben Sie Ihre Pipette und bewegen Sie ihn zur Seite und weg von der Scheibe durch die feinen Bewegungen der Mikromanipulatoren. Sie haben jetzt eine inside-out-Patch und kann in der Inside-Out-Modus aufzeichnen. Sie aus dem Pflaster der Membran, die durch Ihre Pipette eingeschlossen ist (siehe Abb.. 1B) aufnehmen. Wie in der Zelle-attached Modushaben in den Pipettenlösung GABA, um die Kanäle zu aktivieren. Aber können Medikamente, die die Lipid-Doppelschicht Kreuz wie Benzodiazepine, Barbiturate, Propofol etc. in der Badlösung angewendet werden, wie sie in der Lage, in die Pipette Kreuz und modulieren die Kanäle [14]. Der Patch Potential = – Pipette Potenzial und da es keine Ruhemembranpotential als in der Zelle-Attached-Modus überlagert, ist der Patch Potential gleich der-Pipette Potential z. B. wenn Sie die Haltepotential in PClamp bis -40 mV dann den Patch Potenzial ist genau 40 mV. Der Vorteil der inside-out-Konfiguration ist, dass man Medikamente oder Enzyme, um die interne Membranoberfläche anwenden und prüfen, ob es Kanaleigenschaften beeinflusst. Die Kraft der Herstellung der inside-out-Patch nicht auf die Membran-Umgebung des Kanals, die Bildung dieser abgerissene Patch-Konfiguration möglicherweise schonender für die Kanal-Komplex, als wenn die outside-out Patch gebildet gelten (siehe unten) . GABA-aktivierten Kanäle in der Outside-Out-Konfiguration. Wenn in der whole-cell-Modus sanft anheben oder ziehen wieder die Pipette mit dem feinen Bewegungen des Mikromanipulator. Gleichzeitig beobachten die Fenster auf Ihrem Computer, dass der Patch Eigenschaften zeigt. Wie Sie die Pipette ziehen weg aus der Zelle sehen Sie die Kapazität Transienten verschwinden und Sie werden wieder eine GOhm Dichtung. Sie haben jetzt eine outside-out Patch gebildet und kann in der Outside-Out-Modus aufzeichnen. Irgendwie ist der Zellmembran hat über die Spitze Eröffnung der Pipette verschlossen, steht vor der Innenseite der Membran der Pipette im Innen-und die ursprüngliche Außenseite der Membran steht vor der Aufnahme Kammer (Abb. 1B). GABA und anderen Drogen zu untersuchen sind nun in der Badewanne gelöst. Der Patch Potential = Pipette Potential gerade in der whole-cell-Modus z. B., wie wenn Sie den Besitz Potenzial in PClamp auf 40 mV dann den Patch Potenzial ist genau 40 mV. Die Vorteile der outside-out-Modus ist, dass Sie genau wissen, was Ihre Membranpotentials und ist wie die Membran original Außenflächen der experimentellen Kammer, Drogen verwendet werden kann in der Badlösung gelöst und leicht anzuwenden und abgewaschen die Kanäle. Die Nachteile sind, dass Sie nicht mehr können, um den Kanal intrazellulären und sogar Transmembranproteine ​​und Faktoren, die für die vollständige Kanal-Funktion benötigt werden können, angebracht haben, da die Membran musste-over-Dichtung und einige Moleküle möglicherweise verloren gegangen oder in den lokalen Membran-Umgebung in verzerrten den Prozess. Aber gemeinsam die verschiedenen Patch-Konfigurationen erlauben Dissektion der Kanaleigenschaften auf molekularer Ebene, die nicht mit jeder anderen Methode heute möglich. 7. Die Analyse der Ergebnisse: Die Einkanal-und whole-cell Ströme sind mit dem PClamp Software analysiert. Für Analysen der synaptischen Ereignisse, die wir verwenden Synaptosoft (GA, USA) oder AXOGraph (Sydney, Australien). 8. Repräsentative Ergebnisse: Abb.. 2A zeigt Einkanal-Ströme von 20 nM GABA-Konzentration in einer Zelle-attached Patch in Gyrus dentatus Granulat Neuron aktiviert. Die Latenz der Aktivierung des Kanals maximal Leitfähigkeit war 2 Minuten und 38 Sekunden und die maximale Leitfähigkeit lag bei 44 PS 15. Der Patch wurde depolarisiert von 40 mV. Abb.. 2B zeigt Beispiele von whole-cell Voltage-Clamp aktuelle Datensätze aus Ratte Hippocampusneuronen identifizierende tonische und phasische Ströme. Der GABAA-Antagonisten SR95531 hemmt sowohl die extrasynaptische-(Tonika) und dem synaptischen-generated (phasischen) GABA-aktivierten Ströme. Wir verwendeten das GABAA-Antagonisten SR95531 (100 uM) bis (Ba) Gyrus dentatus Neuron und (Bb) Insulin behandelt CA1-Pyramidenzellen Neuron enthüllt die Tonika, der durch die Verschiebung der Grundlinie Strom durch SR95531 Blockierung der extrasynaptische Kanäle (Ba, b) und induzierten das Verschwinden der synaptischen Ströme, wenn SR95531 blockiert die synaptische Kanäle (Bb). Unter basalen Zustand CA1 pyramidalen Neuronen keine Tonic GABA-aktivierten Ströme 6, aber wenn die Neuronen physiologischen Konzentrationen von Insulin 4 GABA-aktivierten Tonic Ströme entwickeln ausgesetzt sind. Abbildung 1A. Rattenhippocampus Hirnschnitt, Regionen identifiziert werden, CA1 und CA3 Pyramidenzellen Schichten und der Gyrus dentatus (DG) Körnerzellschicht. B. Schematische Patch-Clamp-Konfigurationen. 2A. Einkanal-Ströme von 20 nM GABA in einer Zelle-attached Patch auf Gyrus dentatus Körnerzellen in eine Ratte Hippocampus Hirnschnitt aktiviert. Halten Potenzial wurde depolarisiert 40 mV (Pipette Potential = -40 mV). Der Stern (*, 1 st aktuellen Trace) identifiziert, von wo aus die Ströme auf dem schnelleren Zeitskala (2 gezeigtnd aktuellen Trace) aus. B. Whole-cell Ströme in Rattenhippocampus Hirnschnitt in a. Gyrus dentatus Körnerzellen und b. CA1-Pyramidenzellen Neuron in Voltage-Clamp-Modus im Betrieb von -60 mV aufgezeichnet genommen. Für die CA1 Experimenten wurden Scheiben in 1 nM Insulin für 2 h bei Raumtemperatur inkubiert, bevor Ströme wurden aufgezeichnet.