GABA המופעל זרמים ערוץ בודד וטוניק פרוסות המוח עכברוש

1. הכנת פרוסות המוח: הניסויים מתבצעים על פרוסות המוח בהיפוקמפוס מן הלידה 16-22 ימים חולדות הישן Wistar. בעלי חיים מוקרבים על ידי עריפת ראש בהתאם להנחיות אתיות המקומית אישרה פרוטוקולים לטיפול בבעלי חיים. להסיר במהירות את המוח עם מרית ופצע אותו לאורך קו האמצע עם להב כירורגי (# 24). מניחים כל חצי הכדור על נייר Whatman מסנן עם חתך מול הנייר. שים טיפת דבק מגע בדיסק הדגימה והמקום בחצי הכדור על גבי אותו משטח חתך כלפי מטה. הנח את הדיסק הדגימה בחדר החנית של vibratome כי מתמלא נוזל קר כקרח השדרה מלאכותית (ACSF, ראה כאן למטה 3.1). קבע את עובי פרוסה עד 400 מיקרומטר ולהתחיל לחתוך את המוח. תצטרך לחתוך כ 2 מ"מ של רקמת המוח לפני שתגיע בהיפוקמפוס. פרוסות בהיפוקמפוס הם הכניסו לתוך צלחת פטרי זכוכית מלאים ACSF. הצלחת ממוקמת על רקע שחור (נייר שחור למשל) כדי לאפשר הדמיה קל של hippocampi. לבודד את ההיפוקמפוס של הרקמה הסובבת באמצעות סכיני מנתחים חד. היזהר שלא לדחוף או למשוך את הרקמה. Slices מודגרת אז הפתרון ACSF על 37.0 מעלות צלזיוס למשך 1h ולאחר מכן לאחסן בטמפרטורת החדר עד הניסויים נעשים. במהלך הדגירה אחד שעה הרקמה מתאוששת מנזקי שהוטלו על ידי תהליך החיתוך. 2. הכנת pipettes עבור תיקון: Pipettes עשויים זכוכית בורוסיליקט הנימים. תיקון-pipettes נמשכים על מושכי פיפטה אוטומטית או ידנית וכתוצאה מכך pipettes ההתנגדות של 2-4 MΩ להקלטות התא כולו או 8-20 MΩ עבור ערוץ יחיד הקלטות כאשר התמלאו הפתרון פיפטה מתאימים את הפתרון אמבטיה להיות ACSF (ראה להלן, 3.1). Pipettes אנו משתמשים עבור ערוץ יחיד הקלטות הם מלוטש באמצעות microforge שבו החום מכוס נמס יושב על חוט פלטינה עושה פני חלקה יותר. זכוכית בורוסיליקט זהה נמצא את התיקון, pipettes משמש בצורת טיפה זכוכית על חוט. פוליש pipettes זו הדרך הניסיון שלנו יוצר pipettes כי הטופס חותמות התנגדות יציב יותר גבוה לעומת pipettes מלוטש בחום מחוט ללא ציפוי או על ידי צעד ליטוש חולץ האוטומטית. הגודל הסופי של pipettes טווחי 8-20 MΩ. Pipettes בשימוש כל תא הקלטות לא מלוטש. 3. פתרונות המשמשים בניסויים: פתרונות ספציפיים משמשות ערוץ אחד ועל כל תא הקלטות. ACSF מכיל במ"מ: 124 NaCl, 26 NaHCO 3, 3 KCl, 1.3 MgSO 4, 2.5 Na 2 HPO 4, 2.5 CaCl 2, 10 גלוקוז עם pH 7.2-7.4 כאשר מבעבע עם 95% O 2 ו – 5% CO 2. ACSF היא לפעמים בתוספת גם עם חומרים מזינים אחרים, כמו למשל 11 לקטט. ערוץ בודד הקלטות: הפתרון הוא או אמבטיה ACSF או MM: 140 NaCl, KCl 5, 1 MgCl 2, 1.8 CaCl 2 ו 10 TES (N-טריס [hydroxymethyl] methyl-2-aminoethanesulfonic חומצה) pH 7.25 וסמים אחרים זה עשוי להיות נחוץ עבור ניסויים ספציפיים הפתרון פיפטה עבור תיקוני התא מצ"ב מבפנים החוצה במ"מ:. כולין 140 Cl, 5 NaCl, KCl 1, 1 MgCl 2, 1.8 CaCl 2, 10 TES pH 7.25, 200 מיקרומטר saclofen (אנטגוניסט GABAB) ו 0-1 מיקרומטר GABA. במשך מחוץ הקצוב טלאים במ"מ: 140 או כולין Cl NaCl, KCl 0.3, 2 MgCl 2, 0.5 CaCl 2, 5 EGTA, 10 TES pH 7.2-7.4. Whole-cell מתח-clamp הקלטות: הפתרון אמבטיה:. פרוסות הם perfused (2-3 mL / min) עם ACSF עכשיו המכילים חומצה kynurenic גם (3 מ"מ) תרופות אחרות, ייתכן שיהיה צורך עבור ניסויים ספציפיים הפתרון מכיל פיפטה מ"מ: 140 CsCl, 1 CaCl 2, 3 EGTA, 0.5 KCl, 1 MgCl 2, 2 ATP-Mg, 0.3 GTP-Na, 5 QX-314 ברומיד, 10 TES-pH של 7.25 עם CsOH. 4. יצירת אוהם גיגה (GΩ) חותם על תיקון-clamp ניסויים: פרוסות המוח בהיפוקמפוס (איור 1A) מוחזקים בחלק התחתון של תא הקלטת על ידי חוטי ניילון על חוט בצורת פרסה פלטינה. על מנת להמחיש את ארגון רקמה למשל CA1 ו 3 והאזור gyrus משוננת את פרוסות בהיפוקמפוס או תאים ספציפיים, אתה צריך מיקרוסקופ. רוב מעבדות להשתמש במיקרוסקופ זקוף עם יעדים החל 10X ל 60x ובכך מאפשר אחד לזהות אזורים או תאים מסוימים ברקמה. עם זאת, עבור פרוסות תיקון אפילו מיקרוסקופ לנתיחה ניתן להשתמש ואז אתה חזותית לזיהוי אזור, תיקון, אך לא תאים מסוים. סוג זה של תיקון נקרא "תיקון עיוור". אניn בשני המקרים אחד בסופו של דבר הוא תיקון תא בודד באזור מסוים. שיעור ההצלחה דומה עבור שתי השיטות. למרות גופי התא של תאים בהיפוקמפוס העיקרי מאורגנים lamina מובנים מאוד (למשל CA3/CA1 שכבה pyramidale וזיהה כמו להקות בהיר פרוסה המוח בהיפוקמפוס) מפוזרים בין כל תת תחומים ושכבות של ההיפוקמפוס הם גופי התא של מעכבות interneurons שמרכיבים כ -10% מהאוכלוסייה הכוללת 12 העצבית. Interneuron גליה מזדמנים או שעשויים להיות טלוא בתא גרגיר או lamina העצבית פירמידה ניתן להבדיל בין התאים העיקריים של תכונות חשמליות שונות של תאים אלה (ראה ספר ההיפוקמפוס 13). GΩ היווצרות חותם. במהלך הליך זה פיפטה זכוכית איכשהו נקשרת בחוזקה הממברנה התאית של תצורות תיקון שונים (ראה להלן, 4 ו -5) אנו יכולים למדוד את הפעילות של GABA המופעל ערוצי שנמצאים בקרום התא. שים את פיפטה לתוך מחזיק פיפטה ולהדק את הכובע כי מהדק את פיפטה. הגדרות על 200B מגבר Axoclamp הם: V-clamp, קבל 2, kHz 2 Filter, הפוטנציאל הוא מחזיק 0 mV ואנחנו עושים את הניסוי דרך המחשב באמצעות התוכנה PClamp. מכה לתוך חתיכת הפה המצורפת צינור המתחבר למחזיק טפטפת ולסגור את השסתום בין היצירה הפה ואת הצינור. זה יוצר לחץ חיובי פיפטה שלך. הלחץ החיובי פיפטה יש שני תפקידים: הראשון, זרם ייצא פיפטה ופעם פיפטה נכנס לאמבטיה פתרון זה יעזור לשמור את קצה פיפטה נקייה. שנית, החלת יניקה עדין קרום התא באמצעות פיפטה, התיקון הוא חלק חיוני להרכבת באיכות גבוהה, עמידות גבוהה חותם. החותם לעתים קרובות יכול להיווצר רק על ידי פתיחת שסתום השולט לחץ פיפטה. בגלל זה, יש לוודא שאין דליפות אוויר. אתה יכול בקלות לבדוק את ההדלפות על ידי לקיחת בעל עם פיפטה, לטבול אותו לתוך כוס מלא מים לתוך חתיכת מכה את הפה. אם אתה רואה בועות ואז לברוח כל חלק כי הוא לא חזק מספיק. תחתון פיפטה לתוך הפתרון אמבטיה. על מסך המחשב שבו אתה מודד את ההתנגדות פיפטה תראה הדופק מרובע שנוצר על ידי רכבת mV 5 הדופק ומספר אומר לך את ההתנגדות של פיפטה שלך. מספר קטן יותר מייצג קצה פיפטה פתחים, טפטפות גדולות יותר. התאם את פיפטה לקזז 0. איטום על קרום התא. זהה את האזור או את תא אתה הולך התיקון, כלומר, חותם על טופס. בתוך פרוסת המוח אפשר לזהות את גרגיר gyrus משוננת או CA1 ו CA3 פירמידה גוף התא אזורים של ההיפוקמפוס כמו להקות בהיר (ראה איור. 1A) באמצעות הגדלה 10X על מיקרוסקופ או שאנחנו יכולים לזהות את פני השטח נוירונים בודדים פירמידה באמצעות הגדלה 60x. תביאו פיפטה שלך אל המוקד, כך שתוכל לראות גם את האזור שלך / התא ואת פיפטה כשמסתכלים מבעד למיקרוסקופ העין חתיכות. מניחים את פיפטה מעל באמצע התא אזור / באמצעות תנועה גס הגדרות מניפולטור ולהפחית את פיפטה עד שהיא מעל רק לגעת אך לא את הרקמה. מאוד בעדינות נמוך טפטפת שלך על גבי באמצע האזור שלך / תא באמצעות תנועה עדינה הגדרות מניפולטור שלך באותו זמן לראות את מסך המחשב ולעקוב אחר התנגדות פיפטה שלך. תמשיך לזוז פיפטה שלך למטה עד שתראה את ההתנגדות של פיפטה להיות גדול יותר (מספר גבוה יותר). עכשיו, בעדינות לשחרר את הלחץ החיובי פיפטה ידי פתיחת שסתום. הדבר מהווה שאיבה עדינה לעתים קרובות גיגה חותם (חותם עמידות גבוהה, GΩ) צורות automatically.If לא, ולאחר מכן להחיל יניקה אל היצירה הפה שבו הוחל בעבר לחץ חיובי ו-Giga חותם יהוו. אתה צריך לקבל עכשיו את מה שנקרא Cell-Attached תיקון-clamp תצורה (ראה איור. 1B). התאם את הפיצוי קיבול מהיר ואיטי לבטל את הארעיים מגיע פיפטה ובעל פיפטה. על מסך המחשב תוכלו כעת לראות עקבות הנוכחית שטוח. ככל שהערך גבוה יותר חותם GΩ הוא, יותר טוב אות לרעש יחס יהיה לך את ערוץ יחיד הקלטות. זה יכול לפעמים להיות יתרון תיקון בתוך הפרוסה בהיפוקמפוס. במקרים מסוימים התאים יכולים להיות בריאים יותר, כאשר לא על פני השטח כפי שהם מוגנים יותר. כמו כן, במקרה אחד לומד את ההשפעות של הסביבה תאיים על תפקודים תאיים, כגון ההשפעה של ריכוז GABA תאיים על הדור הנוכחי טוניק בנוירונים, תיקון בתוך הרקמה יכולה להיות יתרון. הליך תיקון זהה כמתואר לעיל מלבד אחד, כי לא לשחרר את פולחץ sitive ב פיפטה עד קצה פיפטה בתוך הפרוסה. 5. קביעת התצורה של כל תא וכן כל תא זרמים הקלטה: בתצורה תאים המצורפת, לשנות את הפוטנציאל פיפטה ל -60 mV או קרוב לפוטנציאל המנוחה של קרום התא שלך. החל יניקה אל פיפטה בעזרת צינור המחובר לבעל פיפטה ו באותו זמן לראות את מסך המחשב כדי לציין את השינוי בהתנגדות ואת הארעיים קיבול שמופיעים פעם עברת לתוך התא. כאשר זה קורה שאתה נמצא במצב שנקרא Whole-Cell תצורה או תאים שלמים (איור 1B). ההתנגדות קרום התא משתנה בין סוג תא אחד למשנהו ותלוי המוליכות של תעלות בקרום וכמה פתוחים. קיבול קרום התא משתנה בהתאם לגודל של התא. יניקה צריך להיות בתחילה בעדינות אך אם זה קשה לפרוץ בכוח את התא יותר יכול להיות מיושם. קטניות של יניקה יכול לשמש גם. לפעמים כפיצוי על התנגדות שמתפתח בין פיפטה והתא נדרשת. זה נקרא סדרה או התנגדות גישה (Rs או RA) פיצוי יכול להיעשות גם דרך התוכנה או באופן ידני באמצעות ידית שליטה על מגבר. בניסויים שלנו אנחנו לא לפצות רא אך ניסויים נדחות אם זה משתנה לפי יותר מ -25% מן ההתנגדות הגישה הראשונית. GABA המופעל טוניק זרמים רשמה במצב שלם התא. בתצורה כולו התא CA1 נוירונים בהיפוקמפוס פירמידה הקמנו את הפוטנציאל מחזיק ב – 60 mV ולהמתין 5-10 דקות המאפשר פתרון פיפטה לאזן עם פנים התא. במהלך תקופה זו הקלטה הופך יציב. במהלך הניסוי אנו עוקבים אחר הערך של התנגדות הסדרה. ניסויים נעשים מהדק מתח ואתה למדוד את הזרם דרך אוכלוסיה של ערוצי בקרום התא כולו. אפשר להבדיל בין GABA המופעל זרמים סינפטיים ו extrasynaptic מטבע phasic טוניק של הזרמים. אנטגוניסט SR95531 GABA מעכב כל הזרמים. הירידה הנוכחית מחזיק מצביע על רמה של טוניק-GABA מופעל הנוכחי הנוירון. כאשר אנו מעוניינים הנוכחי GABA המופעל טוניק כי תלוי תאית, GABA הסביבה ב הפרוסה שאנחנו בדרך כלל לא תיקון התאים על פני השטח אלא התאים בתוך הפרוסה. אגוניסטים ואת היריבים שבו אנו משתמשים כדי לווסת את GABA ערוצי מוחלים בפתרון אמבטיה מגיעים תאים בתוך הפרוסה. קצב זרימת הפתרון בתא הניסוי הוא 2-3 מ"ל / דקה. 6. הקלטה בודדת ערוץ זרמים: ניסויים נעשים התא המצורפת, מחוץ בתוך או מחוץ הקצוב תיקון-clamp תצורה (ראה כאן בהמשך), ואנו שיא זרמים דרך ערוץ יחיד מולקולות, אחת ערוץ הזרמים. הגדרות על Axoclamp 200B, V-clamp, עלייה 500, לסנן 2 או 5 kHz. עם התוכנה PClamp אנו שולטים פוטנציאל פיפטה, להגדיר את קצב הדגימה נתונים על לא פחות מ 100 μs ולהקליט את הזרמים. על מנת למזער את הרעש בערוץ יחיד הקלטות נפח הפתרון אמבטיה הנמוך נשמר כך פשוט מכסה את הפרוסה. GABA המופעל ערוצי בתצורת Cell-Attached. כאשר יש לך לקבל חותמת GΩ על הממברנה שאתה נמצא במצב תאים המצורפת, ואתה יכול להקליט את הערוצים כי הם תיקון קרום מוקף פיפטה (ראה איור. 1B). כמו GABA לא לחצות את קרום התא, GABA מוכנס לתוך הפתרון פיפטה כדי להפעיל את הערוצים התיקון. Extrasynaptic GABA המופעל ערוצי להפעיל עם חביון של עד מספר דקות. פוטנציאל התיקון = – כלומר פיפטה פוטנציאל כאשר PClamp תגדיר את הפוטנציאל ב – 40 mV, הוא נרשם על ידי קרום כמו mV 40 depolarized. היתרון של הקלטה במצב תאים המצורפת היא כי הערוץ נמצא בסביבה המקורית שלו, והוא בקשר עם חלבונים תאיים וגורמים נורמלי. החיסרון הוא שאתה לא יודע בדיוק מה פוטנציאל אתה מקליט כמו שאתה לא יודע את פוטנציאל הממברנה מנוחה מוחלטת ואת הפוטנציאל ברחבי התיקון נקבע הן על ידי הפוטנציאל פיפטה ואת פוטנציאל הממברנה המנוחה של התא. GABA המופעל ערוצי בתצורת Inside-Out. כאשר במצב תאים המצורפת בעדינות להרים פיפטה שלך והעבר אותו לצד, הרחק פרוסה באמצעות תנועות קנס של micromanipulators. יש לך עכשיו תיקון מבפנים החוצה והוא יכול להקליט במצב Inside-Out. אתה שיא של התיקון של הממברנה כי הוא מוקף פיפטה שלך (ראה איור. 1B). כמו במצב תאים המצורפת אותךיש GABA בפתרון פיפטה כדי להפעיל את הערוצים. אבל, תרופות לחצות את bilayer השומנים כגון בנזודיאזפינים, ברביטורטים, propofol וכו 'ניתן ליישם את הפתרון אמבטיה כפי שהם יוכלו לעבור לתוך פיפטה ו לווסת את הערוצים [14]. הפוטנציאל תיקון = – פוטנציאל פיפטה ומאז אין פוטנציאל הממברנה מנוחה מעולף כמו במצב תאים המצורפת, את פוטנציאל תיקון שווה למשל פיפטה-פוטנציאל אם תגדיר את הפוטנציאל ההחזקה PClamp ל -40 mV אז את התיקון הפוטנציאל הוא בדיוק 40 mV. היתרון של תצורה בתוך-out היא כי ניתן להחיל סמים או אנזימים אל פני השטח קרום פנימי לבדוק אם הוא משפיע על תכונות הערוץ. הכוח של קבלת התיקון מבפנים החוצה אינו חל על הסביבה הממברנה של ערוץ שהופך את היווצרות תצורת קרע פעמי תיקון זה פוטנציאל עדין יותר מורכב מאשר את הערוץ כאשר התיקון מחוץ הקצוב נוצר (ראה להלן) . GABA המופעל ערוצי בתצורת מחוץ אאוט. כאשר במצב שלם התא בעדינות להרים או להסיט את פיפטה באמצעות תנועות קנס של micromanipulator שלך. במקביל לצפות את החלון במחשב המציג את המאפיינים התיקון. כפי שאתה לצייר את פיפטה מן התא תוכלו לראות את הארעיים קיבול להיעלם תהיה לך שוב חותם GΩ. יש לך עכשיו נוצר התיקון מחוץ החוצה והוא יכול להקליט במצב מחוץ אאוט. איכשהו קרום התא יש אטום על פתיחת קצה פיפטה, את החלק הפנימי של קרום הפנים הפנים פיפטה ואת מחוץ המקורי של קרום התא הפונה הקלטה (איור 1B). תרופות GABA אחרים להיבדק עכשיו הם מומסים בתמיסה אמבטיה. הפוטנציאל תיקון = פוטנציאל פיפטה בדיוק כמו למשל כל תא במצב אם תגדיר את הפוטנציאל ההחזקה PClamp כדי mV 40 אז את הפוטנציאל תיקון בדיוק 40 mV. היתרונות של מצב בחוץ, את זה אתה יודע בדיוק מה פוטנציאל הממברנה שלך וגם בחוץ קרום המקורי פרצופים הקאמרית ניסיונית, סמים לשמש ניתן מומס הפתרון אמבטיה ליישם בקלות ושטף את הערוצים. החסרונות הם שאתה כבר לא יכול להיות מחוברים לערוץ הטרנסממברני חלבונים תאיים ואפילו וגורמים אשר עשוי להיות נחוץ לתפקוד מלא כמו ערוץ הממברנה היה חותם מעל וכמה מולקולות אבדו או לסביבה קרום המקומית מעוותת את התהליך. אבל, יחד בתצורות שונות לאפשר תיקון דיסקציה של מאפייני הערוץ ברמה המולקולרית זה אינו אפשרי עם שיטה אחרת היום. 7. ניתוח התוצאות: זרמים ערוץ אחד ועל כל תא מנותחים עם התוכנה PClamp. עבור ניתוחי הסינפטי אנו משתמשים Synaptosoft (GA, ארה"ב) או AXOGraph (סידני, אוסטרליה). 8. נציג התוצאות: איור. 2A מראה חד ערוץ זרמים מופעלים על ידי ריכוז GABA 20 ננומטר ב תיקון תאים המצורפת ב נוירון gyrus משוננת גרגיר. חביון של הפעלת המוליכות המקסימלית של הערוץ היה 2 דקות ו 38 שניות המוליכות המירבית 44 PS 15. התיקון היה depolarized ידי mV 40. איור. 2B מציג דוגמאות של כל תא מתח-clamp רשומות הנוכחי של נוירונים בהיפוקמפוס עכברוש identifiying טוניק וזרמים phasic. אנטגוניסט GABAA SR95531 מעכב הן את extrasynaptic-(טוניק) ואת הסינפטי שנוצר (phasic) GABA המופעל זרמים. אנחנו מוחלים היריב GABAA SR95531 (100 מיקרומטר) עד (BA) gyrus נוירון משוננת ו (Bb) מטופלים באינסולין CA1 נוירון פירמידלי לחשוף את טוניק הנוכחי על ידי שינוי של הזרם המושרה על ידי הבסיס SR95531 חסימת ערוצי extrasynaptic (BA, ב) היעלמותם של זרמים סינפטיים כאשר SR95531 חוסם את ערוצי הסינפטי (Bb). תחת התנאי הבסיסי CA1 עצב פירמידליים אין טוניק-GABA מופעל זרמים 6 אבל כאשר הנוירונים נחשפים ריכוזים פיזיולוגיים של אינסולין 4-GABA מופעל זרמים טוניק לפתח. איור 1 א. בהיפוקמפוס במוח החולדה פרוסה, אזורים המזוהים הן CA1 ו CA3 שכבות תאים פירמידליים ואת gyrus משוננת (DG) שכבת גרעין התא. סכמטי ב-clamp תיקון תצורות. איור 2A. רווק ערוץ זרמים מופעל על ידי 20 ננומטר GABA בחלקת תא המצורפת על תא gyrus משוננת גרגיר ב פרוסה בהיפוקמפוס במוח חולדה. פוטנציאל אחזקות היה depolarized 40 mV (פוטנציאל פיפטה = -40 mV). הכוכב (*, 1 זכר רחוב הנוכחי) מזהה מאיפה זרמים המוצג על סולם בזמן מהיר יותר (2עקבות nd הנוכחי) נלקח. B. תאים שלמים זרמים נרשם פרוסה בהיפוקמפוס במוח חולדה בתא א גרגיר משוננת gyrus ו ב CA1 נוירון פירמידלי במצב מתח, מהדק את הפוטנציאל החזקת mV -60. עבור CA1 ניסויים, פרוסות הודגרו ב אינסולין 1 ננומטר עבור h 2 בטמפרטורת החדר לפני זרמים נרשמו.