Zebra balığı Pronephros Lazer Ablasyon Böbrek Epitel Rejenerasyon Eğitim
Summary
Insanlarda akut böbrek hasarı (AKI), böbrek nefron oluşturan epitel hücrelerin zarar görmesine neden olduğu yaygın bir klinik sorundur ve AKI, yüksek ölüm oranları% 50-70 ile ilişkili<sup> 1</sup>. Bu fenomenin rehberlik mekanizmaları ve sınırlamalar yeterince anlaşılamamıştır rağmen epitel hücre yıkılmasının ardından, nefron, yenilemek için sınırlı bir yeteneği var. Bu video makalede, zebrafish embriyo böbrek böbrek nefron hücrelerinin hedeflenen lazer ablasyon, veya pronephros için bizim teknik açıklar. AKI nefrotoksisite-kaynaklı modelleri tamamlıyor ve böbrek nefron epitel rejenerasyonu ile ilişkili olan hücre ve moleküler değişiklikler yüksek çözünürlüklü bir anlayış kazanmak için yeni bir yöntem kullanılabilir.
Abstract
Akut böbrek hasarı (AKI), böbrek fonksiyonunun bozulması, böbrek yetmezliği 1 doruğa saat veya gün bir süre içinde yüksek mortalite oranları ile karakterize edilir. AKI iskemi, ilaç toksisitesi veya obstrüktif yaralanma 1 de dahil olmak üzere bir dizi faktörlerin neden olabilir. Bu sonuçlar sıvı ve elektrolit homeostazı korumak için bir yetersizlik. AKI on yıllar boyunca gözlenen olsa da, etkili klinik tedaviler henüz geliştirilecek. İlgi çekici bir zaman, sadece rudimentally 1,2 karakterize edilmiştir gizemli bir fenomen üzerinde, AKI olan bazı hastalarda böbrek fonksiyonları iyileşir. AKI memeli modelleri kullanarak araştırmalar, iskemik ya da nephrotoxin-yaralanan böbrekler nefron tübüller 1,2, epitel hücre tipleri 3 uzman bölgelerde bir dizi (segment) yapılan böbrek fonksiyonel birimleri epitel hücre ölümü deneyim göstermiştir . Nefron içinde proksimal tübül hücrelerinde, epitelyal hücre ölümü en yüksek düzeydedir. Hücre yıkım dediferansiyonunu, yayılması ve tamamen 1,2 nefron yeniden epitel hücreleri, Çevre göç olduğunu göstermektedir kanıt yoktur. Ancak, yaralanan böbrekler yeniden yetenek insanlar arasında geniş bir varyasyon nedenleri bu olaylar modüle sinyaller arasında değişen renal epitelyal rejenerasyon mekanizmaları hakkında birçok cevapsız sorular var.
Larva zebrafish pronephric böbrek 4,5 memeliler dahil olmak üzere yüksek omurgalıların korunmuş nefron oluşan olarak böbrek epitel rejenerasyonu incelemek için mükemmel bir model sağlar. Zebra balığı larvalarının nefron çünkü genç zebrafish 6 göreli şeffaflık floresans teknikleri ile görüntülendi. Böbrekler, hayvan içinde içselleştirilmiş karmaşık sistemlerin yapısal, çünkü bu nefron erişilemez memeli modellerin aksine görüntü hücre ve moleküler değişiklikler, gerçek zamanlı olarak eşsiz bir fırsat sunuyor. Son çalışmalar, aminoglikozid gentamisin AKI ve sonraki böbrek yetmezliği çalışması için toksik bir etken ajan olarak istihdam var: gentamisin ve diğer antibiyotiklere AKI insanlarda neden olduğu gösterilmiştir, ve araştırmacılar zebrafish 7 böbrek hasarı tetiklemek için bu aracı kullanmak için yöntemler formüle sahip , 8. Ancak, Zebra balığı larvaları aminoglikozid toksisitesi etkileri felaket ve öldürücü olan epitelyal rejenerasyon ve fonksiyonu, zaman içinde okuyan bir zorluk sunuyor. Bizim metodumuz zebrafish epitel yaralanma çalışma için yeni bir aracı olarak kullanılması hedeflenen hücre ablasyon sunar. Lazer ablasyon araştırmacılar, hücrelerin sınırlı bir nüfus hücre ölümüne neden yeteneği verir. Hücre Değişen alanları morfolojik konumu, fonksiyonu, hatta belirli bir hücre fenotipi ifade dayanan hedeflenmiş olabilir. Böylece, lazer ablasyon araştırmacıları, çalışma özgüllüğü artacak ve renal epitelyal rejenerasyon mekanizmalarının ışık tutacak yeni ve güçlü bir yaklaşım olabilir. Bu protokol, geniş ilgi bağlamlarda herhangi bir sayıda yaralanma ve rejenerasyon çalışması için zebrafish embriyo diğer organlarda hücre popülasyonlarının hedef uygulanabilir.
Protocol
Discussion
Zebra balığı pek çok bilim yönleriyle boyunca yaygın olarak kullanılan bir model organizmadır, uygulamalar 6 büyüyor. AKI gibi böbrek hastalıkları çalışmada zebrafish model sistem istihdam önemli gözlemler yol açmıştır ve böbrek yaralanması 7,8 incelemek için iyi bir model olmaya devam edecektir. Bir sıralı olmuştur genom ve yerine birçok moleküler protokolleri ile, transgenik modelleri, gen demonte ve misexpression çalışmaları kullanan sofistike zebrafish araştırma gerçekleştirmek için giderek daha kolay hale gelmiştir. Zebra balığı, büyük üretim boyutları ve iyi tanımlanmış bir gelişim evreleri ile kısa bir yaşam döngüsü vardır. Ayrıca, organizmanın diseksiyonu olmadan zebrafish embriyonik ve larva aşamaları görüntüleme çalışmaları mümkün kılan büyük ölçüde şeffaf. Embriyonik ve larva aşamaları boyunca, Zebra balığı, bu gelişim timepoints sırasında görünür kalmasını iki nefron, oluşan bir pronephric böbrek vardır. Zebra balığı pronephric nefron 4,5 akut böbrek yetmezliği çalışmaları için iyi bir model, memeli meslektaşları yapısı ve fonksiyonu ile benzerdir.
Böbrek, vücut sıvı metabolik atıkların temizler organı olarak hizmet veren, insan ve diğer omurgalıların hayatta kalması için çok önemlidir. Bu temizlik fonksiyonu, böbrek nefron kan filtre ve sonra süzüntü değiştirmek salgılanması için azotlu atıkları toplamak ve aynı anda sıvı ve elektrolit dengesini korumak yeteneğine dayanmaktadır. Nefron bir kanal içine kan filtresi, epitel tübül ve drenaj oluşmaktadır. Üç parça yapısal ve işlevsel bütünlüğü nefron fonksiyon ayrılmaz bir parçasıdır. Nephrotoxins maruz kalma, iskemi veya idrar çıkış yolları tıkanıklığı da dahil olmak üzere böbrek çeşitli hakaretler, AKI 1 neden olabilir. AKI, patoloji genellikle akut tübüler nekroz 1,2 ile ilişkilidir. Klinik çalışmalar, takip eden böbrek yetmezliği, böbrek yetmezliği nedeni ve bağlam bağlı olarak,% 7-80 yerden arasında olabilir bir ölüm oranına sahip olduğunu göstermiştir. Ancak, AKI altında yatan neden hızlı tanı ve ters gittikçe nekrotik nefron tübüller rejenerasyon yoluyla kurtarma ile ilişkilidir. Son kaderi haritalama çalışmaları, hasar nefron tübüller doldurur büyük hücre popülasyonu bitişik, yaralanmamış bir şekilde alanlarda 12 kaynaklanan epitel hücreleri olduğunu göstermiştir . Bu bulgular, böbrek kök / progenitör hücrelerin sürecine katılmak ihtimalini ortadan kalkmaz ve bağımsız raporlar kemik iliği kökenli hücreler böbrek rejenerasyon 13 katkıda bulunabileceğini ileri sürmüşlerdir. Bu, devam eden soruşturma renal epitelyal rejenerasyon hücresel kaynakları daha iyi çözmek için gerekli olduğu açıktır.
Nefron yenilenme ve geliştirme payı mezenkimal ve epitelyal fenotipleri arasındaki hücresel devlet anahtarları fenomen. Nefron gelişimi sırasında, mezenkimal progenitör hücreler bazal membran bağlama, tübüler epitelyum 3 oluşturmak için sabit bir fenotip farklılaşırlar. Akut böbrek yetmezliği epitel hücreleri speküle göç fenomeni mezenkimal fenotip içine dediferansiyonunu gerektirir. İlginçtir, son yıllarda yapılan çalışmalarda, hasarlı böbreklerde mezenkimal hücreler, mezenkimal hücre gelişimi 14 sırasında benzer bir ifade profil sergileyen öneririz. Çeşitli raporlar, hücre adezyon molekülleri, matriks proteinleri, sitokinler ve kemokinleri değişiklikler tespit ettik. Epitel geçiş için önerilen mezenkimal hücreler bazal membran yenilemek ve tübüler epitel faaliyetleri yeniden başlatmak. Bu süreçte önemli olan genlerin belirlenmesi, laboratuar ve diğerleri için bir araştırma konusu olmaya devam ediyor. Bu süreçte en önemli faktörlerden aydınlatmak için çalışma yapılacak kalır, ancak bu alanda önemli bir ilerleme gentamisin etkilerini çalışma habercisi olmuştur.
Gentamisin tarafından neden AKI ve böbrek yetmezliği, 15 tıp içinde kullanılan nefrotoksik bileşiklerin yaygınlığı dikkate alındığında, ilgili . Gram-negatif bakteriyel enfeksiyonlar için bir tedavi olarak kullanılır, aminoglikozidler idaresi olguların% 10-25 oranında akut yaralanma açar. Ilaç birlikte birçok tübüler hücrelerde apoptozis veya nekroz ile sonuçlanan bir bolluk, negatif hücresel etkileri neden olur. Çalışmalar megalin ve endositoz yer. Cubulin oluşturduğu karmaşık bir tercihen bağlamak için ilaç bulduk. Bu moleküller, bu hücrelerin ifade sınırlı olmadığı halde, proksimal tübül epitel hücrelerinde bol miktarda bulunur. Indüksiyon oksidatif stres, vazokonstriktörlere serbest bırakılması, hücresel ATP, hipoksi tükenmesi, fosfolipaz inhibisyonu sonucu hücresel sinyal sayesinde, gentamisin ve benzeri antibiyotikler nedenepitel hücrelerinde apoptozis ve nekroz. Ayrıca, antibiyotikler, glomerüler filtrasyon hızı bir düşüş nefron kan filtresi (glomerulus) mezanjiyal daralma tetikler ve kan dolaşımına filtre böbrek yeteneğini olumsuz yönde değiştirerek. Reaktif oksijen türleri, immünostimulan moleküller ve fosfolipaz aktivasyonu üretim, akut böbrek yetmezliğine yol açan bir felaket patoloji oluşturmak nefron diffüz etkileri vardır.
Gentamisin ve benzer antibiyotik çalışmalar var ve böbrek rejenerasyon araştırma için önemli bir araç olmaya devam ederken, bazı sorulara yanıt yararlı olabilir hassas bir eksikliği. Sistemimiz, bu protokolü açıklanan bir lazer ablasyon yöntemi ile birlikte zebrafish kullanarak, böyle kesin bir araştırma aracı ihtiyaca cevap vermektedir. Lazer ablasyon araştırmacılar arasında değişen odak alanlarda böbrek tübül hücre yıkımını uyarmaz, küçük bir rakipsiz hassasiyet ile büyük (50-100) nüfus, (2-3). Bu protokol, tercihen proksimal tübül epitel popülasyonları etiket dekstran-konjugatları maruz kalma, daha önce geliştirilmiş bir yöntem kullanmaktadır. Alternatif olarak, bir veya daha fazla tübül bölgelerde yeşil flüoresan protein ifade transgenik zebrafish hatları kullanılabilir. Örneğin, cadherin17: eGFP transgenik zebrafish (proksimal popülasyonları da olsa zayıf) distal tübül bölgelerde güçlü floresan sergi ve diğer tübül segmentlerinde rejenerasyon çalışmaları 16 için değerli olabilir. Nefron görünürlüğü zaman içinde hücresel değişiklikler zaman atlamalı video kayıt sağlayacaktır. In situ hibridizasyon veya immünohistokimya bütün montaj gibi gen ekspresyon çalışmaları ile birleştiğinde, araştırmacılar zamanla nefron moleküler değişiklikler tespit edebilir. Birlikte ele alındığında, bu tür stratejiler böbrek epitel hücreleri yok edilir sızmak olayların daha dinamik bir anlayış formüle etmeye başlayabilirsiniz.
Lazer ablasyon modelinin en önemli uyarı, insan AKI sızmak fizyolojik şartlar kısmi yönlerini özetlemek olabilir. Ani fiziksel hasar ile indüklenen hücre ölümünü farklı hücrelerde nekroz yol açan olayların çağlayan, ve bu farklı mikroçevrelerde gibi humoral faktörler aynı olmayabilir gibi. Ayrıca, böbrek hasarı sırasında apopitozu kanıt var ve bu sonuçları bir lazer ile aşağıdaki hakaret sızmak olmadığını bilinmemektedir. Ancak, sadece hücre kültürü gibi bazı iyi cevaplar son derece kontrollü bir ortamda gerektiren sorular, lazer ablasyon AKI in vivo modelde son derece kontrollü olarak hizmet edeceği bir araçtır . Gibi anlayışlar, büyük olasılıkla diğer renal yaralanmalar hakkında soruşturma uygulanan ve büyük olasılıkla, insanlar daha iyi teşhis oluşturmak için kullanılan temel anlayışlar keşfi teşvik edecek zebrafish böbrek epitel ablasyon çalışmaları topladı.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz, onun metilselüloz tarifi paylaşımı için yararlı AKI biyoloji ve zebrafish teknikleri tartışmaları ve C. Diep için Wingert laboratuar üyelerine teşekkür ederiz. Yazarlar ayrıca, Zebra balığı koloni için mükemmel devam eden hayvancılık bakım sağlamak için Zebra balığı Araştırma Notre Dame Merkezi personeli için şükranlarımızı ifade etmek istiyoruz. Notre Dame Üniversitesi'nden start-up finansman NIH-NIDDK hibe DK083512 ve cömert bir laboratuar, fon, bu çalışmaları destekledi.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
|---|---|---|
| Embryo dishes | Falcon | 35-1005 |
| Dissection forceps | Roboz | RS-5010 |
| Injection needles | Sutter Intruments | BF100-50-10 |
| Ultrapure agarose | Invitrogen | 16500-500 |
| 40 kilodalton (kD) Dextran-fluorescein | Invitrogen | D1845 |
| Plastic transfer pipet | Samco Scientific, Fisher | 204, 13-711-23 |
| Tricaine | Sigma | E10521 |
| Methylcellulose | Sigma | M0262 |
| Depression slide | Fisher | S175201 |
| 12-well dish | Corning | 3512 |
References
- Thadhani, R., Pascual, M., Bonventre, J. V. Acute renal failure. New Eng. J. Med. 334, 1448-1460 (1996).
- Bonventre, J. V. Dedifferentiation and proliferation of surviving epithelial cells in acute renal failure. J Am. Soc. Nephrol. 14, 55-61 (2003).
- Dressler, G. R. The cellular basis of kidney development. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 22, 509-529 (2006).
- Wingert, R. A., Selleck, R., Yu, J., Song, H. D., Chen, Z., Song, A., Zhou, Y., Thisse, B., Thisse, C., McMahon, A. P., Davidson, A. J. The cdx genes and retinoic acid control the positioning and segmentation of the zebrafish pronephros. PLoS Genet. 3, 1922-1938 (2007).
- Wingert, R. A., Davidson, A. J. The zebrafish pronephros: a model to study nephron segmentation. Kidney Int. 73, 1120-117 (2008).
- Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nat. Rev. Genet. 8, 353-367 (2007).
- Hentschel, D. M., Park, K. M., Cilenti, L., Zervos, A. S., Drummond, I. A., Bonventre, J. V. Acute renal failure in zebrafish: a novel system to study a complex disease. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 288, 923-9229 (2005).
- Cosentino, C. i. a. n. c. i. o. l. o., Roman, C., Drummond, B. L., A, I., Hukriede, N. A. Intravenous Microinjections of Zebrafish Larvae to Study Acute Kidney Injury. J Vis Exp. (42), e2079-e2079 (2010).
- Drummond, I. A., Majumdar, A., Hentschel, H., Elger, M., Solnica-Krezel, L., Schier, A. F., Neuhauss, S. C. F., Stemple, D. L., Zwartkruis, F., Rangini, Z., Driever, W., Fishman, M. C. Early development of the zebrafish pronephros and analysis of mutations affecting pronephric function. Development. 125, 4655-4657 (1998).
- Westerfield, M. . The Zebrafish Book. , (2000).
- Kemp, H. A., Carmany-Rampey, A., Moens, C. Generating chimeric zebrafish embryos by transplantation. J. Vis. Exp. (29), e1394-e1394 (2009).
- Humphreys, B. D., Valerius, M. T., Kobayashi, A., Mugford, J. W., Soeng, S., Duffield, J., McMahon, A. P., Bonventre, J. V. Intrinsic epithelial cells repair the kidney after injury. Cell Stem Cell. 2, 284-291 (2008).
- Bussolati, B., Hauser, P. V., Carvalhosa, R., Camussi, G. Contribution of stem cells to kidney repair. Curr. Stem Cell Res. Therapy. 4, 2-8 (2009).
- Devarajan, P. Update on mechanisms of ischemic acute kidney injury. J. Am. Soc. Nephrol. 17, 1503-1520 (2006).
- Lopez-Novoa, J. M., Quiros, Y., Vicente, L., Morales, A. I., Lopez-Hernandez, F. J. New insights into the mechanism of aminoglycoside nephrotoxicity: an integrative point of view. Kid. Int. , (2010).
- Diep, C. Q., Ma, D., Holm, T., Naylor, R., Arora, N., Wingert, R., Bollig, F., Djordjevic, G., Lichman, B., Zhu, H. Identification of adult nephron progenitors capable of kidney regeneration in zebrafish. Nature. 470, 95-100 (2011).
