Лазерной абляции предпочки данио рерио по изучению почечных эпителиальных Регенерация
Summary
Острое повреждение почек (АКИ) в организме человека является распространенной клинической проблемой вызвано повреждением эпителиальных клеток, которые составляют почки нефронов, и AKI связано с высокими показателями смертности на 50-70%<sup> 1</sup>. После разрушения клеток эпителия, нефроны имеют ограниченную способность к регенерации, хотя механизмы и ограничения, которыми руководствуются этим явлением остается мало изучен. В этом видео статье мы описываем нашу технику для целевого лазерной абляции клетки почек нефрона в почке эмбрионов данио, или предпочки. Наш новый метод может быть использован в дополнение к нефротоксичности вызванных моделей AKI и получить высокое разрешение понимание клеточной и молекулярной изменения, связанные с регенерацией эпителия в почках нефрона.
Abstract
Acute kidney injury (AKI) is characterized by high mortality rates from deterioration of renal function over a period of hours or days that culminates in renal failure1. AKI can be caused by a number of factors including ischemia, drug-based toxicity, or obstructive injury1. This results in an inability to maintain fluid and electrolyte homeostasis. While AKI has been observed for decades, effective clinical therapies have yet to be developed. Intriguingly, some patients with AKI recover renal functions over time, a mysterious phenomenon that has been only rudimentally characterized1,2. Research using mammalian models of AKI has shown that ischemic or nephrotoxin-injured kidneys experience epithelial cell death in nephron tubules1,2, the functional units of the kidney that are made up of a series of specialized regions (segments) of epithelial cell types3. Within nephrons, epithelial cell death is highest in proximal tubule cells. There is evidence that suggests cell destruction is followed by dedifferentiation, proliferation, and migration of surrounding epithelial cells, which can regenerate the nephron entirely1,2. However, there are many unanswered questions about the mechanisms of renal epithelial regeneration, ranging from the signals that modulate these events to reasons for the wide variation of abilities among humans to regenerate injured kidneys.
The larval zebrafish provides an excellent model to study kidney epithelial regeneration as its pronephric kidney is comprised of nephrons that are conserved with higher vertebrates including mammals4,5. The nephrons of zebrafish larvae can be visualized with fluorescence techniques because of the relative transparency of the young zebrafish6. This provides a unique opportunity to image cell and molecular changes in real-time, in contrast to mammalian models where nephrons are inaccessible because the kidneys are structurally complex systems internalized within the animal. Recent studies have employed the aminoglycoside gentamicin as a toxic causative agent for study of AKI and subsequent renal failure: gentamicin and other antibiotics have been shown to cause AKI in humans, and researchers have formulated methods to use this agent to trigger kidney damage in zebrafish7,8. However, the effects of aminoglycoside toxicity in zebrafish larvae are catastrophic and lethal, which presents a difficulty when studying epithelial regeneration and function over time. Our method presents the use of targeted cell ablation as a novel tool for the study of epithelial injury in zebrafish. Laser ablation gives researchers the ability to induce cell death in a limited population of cells. Varying areas of cells can be targeted based on morphological location, function, or even expression of a particular cellular phenotype. Thus, laser ablation will increase the specificity of what researchers can study, and can be a powerful new approach to shed light on the mechanisms of renal epithelial regeneration. This protocol can be broadly applied to target cell populations in other organs in the zebrafish embryo to study injury and regeneration in any number of contexts of interest.
Protocol
Discussion
Данио является широко используемой моделью организма на протяжении многих областях науки, применение которых растут 6. Применение системы данио модели в исследовании почечных заболеваний, как AKI привело к важным наблюдениям и будет продолжать быть хорошей моделью для изучения почки 7,8. С генома, которая была последовательной и многие молекулярные протоколов на месте, она становится все более легко выполнять сложные исследования данио, которая использует трансгенных моделей, генной нокдаун и misexpression исследований. Данио имеет короткий жизненный цикл с большими размерами поколения и четко определенных стадиях развития. Кроме того, данио эмбриональных и личиночной стадии в значительной степени прозрачным, что делает изображение исследования невозможны без рассечения организма. На протяжении эмбриональной и личиночной стадии, данио имеет pronephric почки состоит из двух нефронов, которые остаются видимыми в течение этих timepoints развития. Данио рерио pronephric нефронов аналогичны по структуре и функции с их коллегами млекопитающих, что делает его хорошей моделью для исследования острой почечной недостаточность 4,5.
Почка имеет решающее значение для выживания человека и других позвоночных, выступающей в качестве органа, который очищает организм от жидких отходов метаболизма. Это очищение функция опирается на способность почек нефронов для фильтрации крови, а затем изменить для сбора фильтрата азотистые отходы для секреции и одновременно поддерживать водно-солевой баланс. Нефронов состоят из крови фильтр, эпителиальные трубочки, и впадают в проток. Структурную и функциональную целостность всех трех частей является неотъемлемой частью нефрона функции. Различные оскорбления в почках, в том числе воздействия нефротоксины, ишемия, или обструкции мочевыводящих путей оттока может привести к AKI 1. Патология AKI часто ассоциируется с острым трубчатых 1,2 некроза. Клинические исследования показали, что возникающее в результате почечной недостаточности, смертность, которая может варьироваться от 7-80% в зависимости от причины и контекст почечной недостаточности. Тем не менее, экспресс-диагностики и изменение основной причиной AKI все чаще ассоциируется с восстановлением через регенерацию некротических канальцах нефрона. Недавние исследования отображение судьбы показали, что основные популяции клеток, которые повторно заполняет поврежденные канальцы нефрона являются эпителиальные клетки, которые происходят из соседних, неповрежденных областях 12. Эти выводы не исключают возможность, что почечная стволовых / прогениторных клеток, может участвовать в процессе, и независимые отчеты показали, что костный мозг клеток, полученных может способствовать почечной регенерации 13. Ясно, что продолжение исследования, чтобы лучше решать сотовой источников почечных эпителиальных регенерации.
Оба регенерации нефрона и развития доли явление переключателей в сотовых состояние между мезенхимальные и эпителиальные фенотипы. В процессе разработки нефрона, мезенхимальных клеток-предшественников дифференцироваться в стационарных фенотип, подключение к базальной мембраны для формирования трубчатого эпителия 3. Предположил феномена миграции эпителиальных клеток после острой почечной недостаточности требует дедифференцировки в мезенхимальных фенотипа. Интересно, что последние исследования показывают, что мезенхимальных клеток в поврежденных почках выставку выражение профиль похожа на мезенхимальные клетки во время развития 14. Различные отчеты обнаружили изменений в клеточных молекул адгезии, матричные протеины, цитокинов и хемокинов. После предлагаемой мезенхимальных в эпителиальных перехода, клетки собрать на базальной мембране и возобновить трубчатых эпителиальных деятельности. Определение генов важна в этом процессе по-прежнему является темой исследований нашей лаборатории и другие. Большая часть работы, чтобы выяснить ключевых факторов в этом процессе еще предстоит сделать, но значительного прогресса в области была объявлена по изучению последствий гентамицин.
AKI и почечной недостаточности, вызванной гентамицин актуальна учитывая распространенность нефротоксических соединения, применяемые в медицине 15. Используется для лечения грам-отрицательных бактериальных инфекций, администрация аминогликозидов приводит к острой травмы в 10-25% случаев. Препарат вызывает множество отрицательных клеточные эффекты, а также в результате апоптоза или некроза во многих трубчатых клеток. Исследования показали препарата связываются преимущественно с комплекс, образованный megalin и cubulin, которая участвует в эндоцитоза. Эти молекулы можно найти в изобилии в эпителиальных клетках проксимальных канальцах, хотя они не ограничиваются выражением в этих клетках. Через сотовой сигнализации в результате индукции окислительного стресса, выпуск вазоконстрикторов, истощение клеточных АТФ, гипоксия, угнетение фосфолипаз, гентамицин и аналогичные антибиотики вызываютапоптоза и некроза в эпителиальных клетках. Кроме того, антибиотики вызвать мезангиальных спад в крови нефрона фильтр (клубочки), что приводит к падению скорости клубочковой фильтрации и отрицательно меняют способность почки для фильтрации крови. Производство активных форм кислорода, иммуностимулирующие молекул, и активация фосфолипаз имеют диффузные эффекты в нефрона, создавая катастрофические патологии, что приводит к острой почечной недостаточности.
Хотя гентамицин и подобные антибиотикам исследования были и продолжают оставаться важными инструментами для исследования почек регенерации, им не хватает точности, которые могут быть полезны в решении некоторых вопросов. Наша система использования данио в сочетании с методом лазерной абляции, описанные в этом протоколе ответы нуждаются в такой точный инструмент исследования. Лазерной абляции позволяет исследователям, чтобы вызвать разрушение клеток в ключевых областях деятельности почечных канальцев, начиная от небольших (2-3) и крупных (> 50-100) населения, с непревзойденной точностью. В этом протоколе, мы используем ранее разработанный метод воздействия декстран-сопряженных с преимущественно этикетке проксимальных канальцах эпителиальных населения. Кроме того, трансгенные линии данио, которые выражают зеленого флуоресцентного белка в одном или нескольких регионах трубочка может быть использовано. Например, cadherin17: EGFP трансгенных данио проявляют сильное флуоресценции в дистальных отделах канальцев (хотя и слаб в проксимальных групп населения), и может быть полезен для изучения регенерации в других сегментах канальцев 16. Видимость нефрона позволит замедленной видеозаписи клеточные изменения с течением времени. В сочетании с генной экспрессии исследования, такие как целые горы на месте гибридизации или иммуногистохимии, исследователи могут обнаружить молекулярные изменения в нефрона с течением времени. Взятые вместе, эти стратегии могут приступить к разработке более динамичным понимание событий, которые испаряют при почечных эпителиальных клеток, уничтожаются.
Основные предостережение нашей модели лазерной абляции в том, что оно может резюмировать частичные аспекты физиологических условиях, что происходить в человеческом AKI. Индуцированной гибели клеток путем мгновенного физического ущерба отличается от каскад событий, который приводит к некрозу клеток, и как таковой гуморальных факторов в этих различных микросреды не могут быть идентичными. Кроме того, существует свидетельство апоптоз в почки, и неизвестно, будет ли такие последствия происходить следующее оскорбление с помощью лазера. Однако, как культура клеток является инструментом, который лучше отвечает на некоторые вопросы, которые требуют высокой контролируемой среде, лазерная абляция будет служить строго контролируемых в естественных условиях модель AKI. Таким образом, идеи почерпнуты из почечных эпителиальных исследования абляции в данио, скорее всего, способствовать открытию фундаментальной идеи, которые могут быть применены к исследованию других почечных травм и, возможно, используется для создания лучшей диагностики у людей.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим членов лаборатории Wingert за полезные обсуждения AKI биологии и данио методов и С. Дьеп для обмена его метилцеллюлозы рецепт. Авторы также хотели бы выразить нашу благодарность сотрудникам Нотр-Дам Центр исследований данио рерио за предоставление отличной постоянного ухода хозяйства для нашей данио колонии. Финансирование из NIH-NIDDK гранта до DK083512, и щедрый лаборатории начального финансирования из Университета Нотр-Дам, при поддержке этой работы.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
|---|---|---|
| Embryo dishes | Falcon | 35-1005 |
| Dissection forceps | Roboz | RS-5010 |
| Injection needles | Sutter Intruments | BF100-50-10 |
| Ultrapure agarose | Invitrogen | 16500-500 |
| 40 kilodalton (kD) Dextran-fluorescein | Invitrogen | D1845 |
| Plastic transfer pipet | Samco Scientific, Fisher | 204, 13-711-23 |
| Tricaine | Sigma | E10521 |
| Methylcellulose | Sigma | M0262 |
| Depression slide | Fisher | S175201 |
| 12-well dish | Corning | 3512 |
References
- Thadhani, R., Pascual, M., Bonventre, J. V. Acute renal failure. New Eng. J. Med. 334, 1448-1460 (1996).
- Bonventre, J. V. Dedifferentiation and proliferation of surviving epithelial cells in acute renal failure. J Am. Soc. Nephrol. 14, 55-61 (2003).
- Dressler, G. R. The cellular basis of kidney development. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 22, 509-529 (2006).
- Wingert, R. A., Selleck, R., Yu, J., Song, H. D., Chen, Z., Song, A., Zhou, Y., Thisse, B., Thisse, C., McMahon, A. P., Davidson, A. J. The cdx genes and retinoic acid control the positioning and segmentation of the zebrafish pronephros. PLoS Genet. 3, 1922-1938 (2007).
- Wingert, R. A., Davidson, A. J. The zebrafish pronephros: a model to study nephron segmentation. Kidney Int. 73, 1120-117 (2008).
- Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nat. Rev. Genet. 8, 353-367 (2007).
- Hentschel, D. M., Park, K. M., Cilenti, L., Zervos, A. S., Drummond, I. A., Bonventre, J. V. Acute renal failure in zebrafish: a novel system to study a complex disease. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 288, 923-9229 (2005).
- Cosentino, C. i. a. n. c. i. o. l. o., Roman, C., Drummond, B. L., A, I., Hukriede, N. A. Intravenous Microinjections of Zebrafish Larvae to Study Acute Kidney Injury. J Vis Exp. (42), e2079-e2079 (2010).
- Drummond, I. A., Majumdar, A., Hentschel, H., Elger, M., Solnica-Krezel, L., Schier, A. F., Neuhauss, S. C. F., Stemple, D. L., Zwartkruis, F., Rangini, Z., Driever, W., Fishman, M. C. Early development of the zebrafish pronephros and analysis of mutations affecting pronephric function. Development. 125, 4655-4657 (1998).
- Westerfield, M. . The Zebrafish Book. , (2000).
- Kemp, H. A., Carmany-Rampey, A., Moens, C. Generating chimeric zebrafish embryos by transplantation. J. Vis. Exp. (29), e1394-e1394 (2009).
- Humphreys, B. D., Valerius, M. T., Kobayashi, A., Mugford, J. W., Soeng, S., Duffield, J., McMahon, A. P., Bonventre, J. V. Intrinsic epithelial cells repair the kidney after injury. Cell Stem Cell. 2, 284-291 (2008).
- Bussolati, B., Hauser, P. V., Carvalhosa, R., Camussi, G. Contribution of stem cells to kidney repair. Curr. Stem Cell Res. Therapy. 4, 2-8 (2009).
- Devarajan, P. Update on mechanisms of ischemic acute kidney injury. J. Am. Soc. Nephrol. 17, 1503-1520 (2006).
- Lopez-Novoa, J. M., Quiros, Y., Vicente, L., Morales, A. I., Lopez-Hernandez, F. J. New insights into the mechanism of aminoglycoside nephrotoxicity: an integrative point of view. Kid. Int. , (2010).
- Diep, C. Q., Ma, D., Holm, T., Naylor, R., Arora, N., Wingert, R., Bollig, F., Djordjevic, G., Lichman, B., Zhu, H. Identification of adult nephron progenitors capable of kidney regeneration in zebrafish. Nature. 470, 95-100 (2011).
