אבחון מהיר של וירוס שפעת העופות בעופות בר: שימוש ניידים rRT-PCR ו מיובשים בהקפאה ריאגנטים בתחום
Summary
מחקר זה מתאר את האבחנה של שפעת העופות בעופות בר באמצעות מערכת ניידת rRT-PCR. השיטה מנצלת מיובשים בהקפאה ריאגנטים למסך ציפורי בר בסביבה הלא במעבדה, תרחיש טיפוסי של התפרצות. שימוש בכלים מולקולריים מספק חלופות מדויק ורגיש לאבחון מהיר.
Abstract
ציפורי בר היו מעורבים התפשטות שפעת העופות מאוד פתוגניים (HPAI) של תת סוג H5N1, שגרם מעקב לאורך flyways נודדות. דגימה של ציפורי בר וירוס שפעת העופות (AIV) מתנהל לעתים קרובות באזורים נידחים, אבל התוצאות הן לעתים קרובות מתעכב בשל הצורך להעביר דגימות למעבדה מצויד לבדיקה מולקולרית. בזמן אמת transcriptase הפוכה polymerase תגובת שרשרת (rRT-PCR) היא טכניקה מולקולרית המציע אחת השיטות המדויקות ביותר ורגישה לאבחון של AIV. פרוטוקולים המעבדה קפדנית בעבר הדרושים rRT-PCR כיום להיות מותאמים עבור השדה. פיתוח של חומרים כימיים מיובשים בהקפאה (lyophilized) שאינם דורשים שרשרת קר, עם רגישות ברמה של ריאגנטים רטוב הביא באתר בדיקות מרחוק מטרה מעשית.
כאן אנו מציגים שיטה לאבחון מהיר של AIV בעופות בר באמצעות יחידת rRT-PCR (מכשיר מתקדם Ruggedized זיהוי הפתוגן או RAPID, איידהו טכנולוגיות, סולט לייק סיטי, יוטה) המעסיקה ריאגנטים lyophilized (1 שפעת יעד TaqMan; ASAY -ASY-0109, איידהו טכנולוגיות). ריאגנטים להכיל את כל המרכיבים הדרושים לצורך בדיקות בריכוזים המתאימים שפופרת אחת: primers, בדיקות, אנזימים, מאגרים בקרות פנימיות חיוביות, ביטול שגיאות הקשורות אחסון לא נכון או טיפול של ריאגנטים רטוב. יחידה ניידת מבצע מסך לשפעת על ידי מיקוד הגן מטריצה והתשואות תוצאות 2-3 שעות. Subtyping גנטית אפשר גם עם פריימר H5 ו – H7 קובע כי היעד של הגן hemagglutinin.
המערכת הוא מתאים לשימוש על דגימות ביוב ו הלוע התחתון שנאספו ציפורי בר, כפי שהודגם כאן על מינים נודדים shorebird, ביצנית המערבי (Calidrus mauri) כבשו בצפון קליפורניה. טיפול בבעלי חיים בעקבות הפרוטוקולים שאושרו על ידי טיפול בבעלי חיים ועדת שימוש הגיאולוגי בארה"ב סקר המערבי מרכז מחקר אקולוגי והיתרים של בירד בארה"ב סקר גיאולוגי banding מעבדה. היתרון העיקרי של טכניקה זו היא לזרז את האבחון של ציפורי בר, להגדיל את הסיכויים של המכיל התפרצות במיקום מרוחק. באתר אבחנה גם להיות שימושי עבור זיהוי לומדים אנשים נגועים באוכלוסיות הבר. ההזדמנות לאסוף מידע על הביולוגיה מארח (בתגובה החיסונית לזיהום פיזיולוגיים) ואקולוגיה מרחבית (ביצועים הנדידה של עופות נגועים) יספק תובנות המידה שבה ציפורי בר יכולים לשמש וקטורים עבור AIV על פני מרחקים ארוכים.
Protocol
Discussion
שיטת אבחון מהיר המוצג כאן מאפשר בדיקה זמן יעיל ומדויק של דגימות צפור פראית למעקב של AIV. אחסון הרבה פחות מחמירים הדגימה דרישות ניידים rRT-PCR מתאים למצבים מרוחקים שבהם תחזוקה של רשת קר עשוי להיות מעשי אם משלחים חנקן נוזלי או קרח יבש אינו זמין. בנוסף, מצאנו כי ניתוח דגימה עם…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מבקשים להודות מ משרתים ור קריספ איידהו טכנולוגיות תמיכה טכנית המערבי USGS מרכז אקולוגי מחקר למימון (ס Schwarzbach) וסיוע (ק Spragens, ט 'גרהם). מחקר זה נערך תחת חסותו של המרכז לטכנולוגיה חדשנית – המכון לחקר הביטחון לביטחון פנים (www.idhs.org), תמיכה של משרד ההגנה ואת חיל האוויר במעבדת המחקר. טיפול בבעלי חיים בעקבות הפרוטוקולים שאושרו על ידי טיפול בבעלי חיים ועדת שימוש הגיאולוגי בארה"ב סקר המערבי מרכז מחקר אקולוגי והיתרים של בירד בארה"ב סקר גיאולוגי banding מעבדה. כל שימוש בשמות המסחר, מוצר או חברה בפרסום זה נועד למטרות תיאורי בלבד, אינה מעידה על אישור על ידי ממשלת ארה"ב.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue Number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| RNeasy mini spin column | Qiagen | 74106 | Included in RNeasy Mini Kit |
| Collection tubes (1.5 & 2 mL) | Qiagen | 74106 | Included in RNeasy Mini Kit |
| Buffer RLT | Qiagen | 74106 | Included in RNeasy Mini Kit |
| Buffer RW1 | Qiagen | 74106 | Included in RNeasy Mini Kit |
| Buffer RPE | Qiagen | 74106 | Included in RNeasy Mini Kit |
| RNase-free water | Qiagen | 74106 | Included in RNeasy Mini Kit |
| 14.3 M β-mercaptoethanol solution | Fisher Scientific | BP176100 | |
| 100% ethanol | Fisher Scientific | NC9602322 | |
| Vortex Genie 2, 120V | Scientific Industries | SI-0236 | |
| Taqman Influenza A Target 1 (Hydrolysis Probe) | Idaho Technologies | ASAY-ASY-0109 | |
| Lightcycler 20ml capillary tubes | Roche Applied Science | 04929292001 | |
| Micro-centrifuge with rotator for 2 ml tubes | Idaho Technologies | Included in RAPID kit | |
| Ruggedized Advanced Pathogen Identification Device (RAPID) 7200 | Idaho Technologies | Included in RAPID kit | |
| Pentium-based laptop with Windows XP Professional | Idaho Technologies | Included in RAPID kit | |
| Lightcycler Data Analysis software | Idaho Technologies | Included in RAPID kit |
References
- Spackman, E. Development of a real-time reverse transcriptase PCR assay for type A influenza virus and the avian H5 and H7 hemagglutinin subtypes. J Clin Microbiol. 40, 3256-3260 (2002).
- Takekawa, J. Y. Field detection of avian influenza virus in wild birds: evaluation of a portable rRT-PCR system and freeze-dried reagents. J Virol Methods. 166, 92-97 (2010).
- Das, A., Spackman, E., Senne, D., Pedersen, J., Suarez, D. L. Development of an internal positive control for rapid diagnosis of avian influenza virus infections by real-time reverse transcription-PCR with lyophilized reagents. J Clin Microbiol. 44, 3065-3073 (2006).
- Spackman, E., Suarez, D. L. Avian influenza virus RNA extraction from tissue and swab material. Methods Mol Biol. 436, 13-18 (2008).
- Chen, R., Holmes, E. C. Frequent inter-species transmission and geographic subdivision in avian influenza viruses from wild birds. Virology. , 383-3156 (2009).
- Macken, C. A., Webby, R. J., Bruno, W. J. Genotype turnover by reassortment of replication complex genes from avian influenza A virus. J Gen Virol. 87, 2803-2815 (2006).
- Dugan, V. G. The evolutionary genetics and emergence of avian influenza viruses in wild birds. PLoS Pathog.. 4, e1000076-e1000076 (2008).
- Spackman, E. Phylogenetic analyses of type A influenza genes in natural reservoir species in North America reveals genetic variation. Virus Res. 114, 89-100 (2005).
- Pasick, J. Advances in the molecular based techniques for the diagnosis and characterization of avian influenza virus infections.. Transbound Emerg Dis. 55, 329-338 (2008).
- . OIE Manual of diagnostics tests and vaccines for terrestrial animals (mammals, birds and bees). 1, 258-269 (2004).
- Weber, T. P., Stilianakis, N. I. Ecologic immunology of avian influenza (H5N1) in migratory birds. Emerg. Infect. Dis. 13, 1139-1143 (2007).
- Kim, J. -. K., Negovetich, N. J., Forrest, H. L., Webster, R. G. Ducks: the “Trojan Horses” of H5N1 influenza. Influenza and Other Respiratory Viruses. , 121-128 (2009).
- Gilbert, M. Flying over an infected landscape: distribution of highly pathogenic avian influenza H5N1 risk in South Asia and satellite tracking of wild waterfowl. Ecohealth. , (2010).
