Een snelle diagnose van aviaire influenza virus bij wilde vogels: Het gebruik van een Portable RRT-PCR en gevriesdroogd reagentia in het veld
Summary
Deze studie beschrijft diagnose van aviaire influenza bij wilde vogels met behulp van een draagbare RRT-PCR-systeem. De methode maakt gebruik van gevriesdroogde reagentia om het scherm wilde vogels in een niet-laboratorium setting, typisch voor een uitbraak scenario. Het gebruik van moleculaire technieken biedt nauwkeurige en gevoelige alternatieven voor een snelle diagnose.
Abstract
Wilde vogels zijn betrokken bij de verspreiding van hoogpathogene aviaire influenza (HPAI) van het H5N1 subtype, wordt gevraagd het toezicht langs trekkende vliegroutes. Bemonstering van wilde vogels voor aviaire influenza virus (AIV) is vaak uitgevoerd in afgelegen gebieden, maar de resultaten zijn vaak vertraagd vanwege de noodzaak om monsters te vervoeren naar een laboratorium ingericht voor moleculaire testen. Real-time reverse transcriptase polymerase chain reaction (RRT-PCR) is een moleculaire techniek die een van de meest nauwkeurige en gevoelige methoden voor de diagnose van AIV biedt. De eerder strenge laboratorium protocollen die nodig is voor RRT-PCR worden nu aangepast voor het veld. Ontwikkeling van gevriesdroogd (gelyofiliseerd) reagentia die geen 'cold chain', met gevoeligheid bij het niveau van de natte reagentia heeft gebracht on-site testen op afstand tot een praktisch doel.
Hier presenteren we een methode voor de snelle diagnose van de AIV bij wilde vogels met behulp van een RRT-PCR-eenheid (Ruggedized Uitgebreid Pathogeen Identification Device of RAPID, Idaho Technologies, Salt Lake City, UT) dat gevriesdroogd reagentia werken (Influenza A Target een Taqman; Asay -ASY-0109, Idaho Technologies). De reagentia bevatten alle noodzakelijke componenten voor het testen op geschikte concentraties in een enkele buis: primers, probes, enzymen, buffers en interne positieve controles, waardoor fouten in verband met onjuiste opslag of overslag van natte reagentia. De draagbare eenheid voert een scherm voor het Influenza A door zich te richten de matrix-gen en levert resultaten binnen 2-3 uur. Genetische subtypering is ook mogelijk met H5 en H7 primer sets die gericht zijn op de hemagglutinine-gen.
Het systeem is geschikt voor gebruik op cloaca-en orofaryngeale monsters van wilde vogels, zoals hier gedemonstreerd op de trekkende shorebird soort, de westelijke oeverloper (Calidrus Mauri), gevangen in Noord-Californië. Dieren omgaan gevolgd protocollen zijn goedgekeurd door de Animal Care en gebruik Comite van de US Geological Survey West-Ecologisch Research Center en maakt van de US Geological Survey Bird Banding Laboratory. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is te versnellen diagnose van wilde vogels, het vergroten van de kans op een uitbraak op een externe locatie. On-site diagnose zou ook nuttig voor het identificeren en bestuderen van geïnfecteerde individuen in wilde populaties. De mogelijkheid om informatie op de host biologie (immunologische en fysiologische reactie op infectie) en ruimtelijke ecologie (trek de prestaties van geïnfecteerde vogels) te verzamelen geeft inzicht in de mate waarin de wilde vogels kan fungeren als vectoren voor AIV over lange afstanden.
Protocol
Discussion
De methode van een snelle diagnose hier gepresenteerde maakt tijd-efficiënte en nauwkeurige testen van wilde vogels monsters voor bewaking van de AIV. De veel minder strenge exemplaar opslag eisen van draagbare RRT-PCR zijn geschikt voor het op afstand situaties waarin het onderhoud van een 'cold chain' kan onpraktisch als vloeibare stikstof verladers of droog ijs is niet beschikbaar. Daarnaast vonden we dat monster-analyse met gevriesdroogde reagentia was eenvoudig genoeg om te worden uitgevoerd door veldbiolo…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij willen M. en R. Scullion Crisp van Idaho Technologies bedanken voor technische ondersteuning en het USGS West-Ecologisch Research Center voor de financiering van (S. Schwarzbach) en bijstand (K. Spragens, T. Graham). Dit onderzoek werd uitgevoerd onder auspiciën van het Centrum voor Innovatieve technologie – Instituut voor Defensie en Binnenlandse Veiligheid (www.idhs.org), ter ondersteuning van het ministerie van Defensie en Air Force Research Laboratory. Dieren omgaan gevolgd protocollen zijn goedgekeurd door de Animal Care en gebruik Comite van de US Geological Survey West-Ecologisch Research Center en maakt van de US Geological Survey Bird Banding Laboratory. Elk gebruik van de handel, product of bedrijf namen in deze publicatie is voor beschrijvende doeleinden en impliceert geen goedkeuring door de Amerikaanse overheid.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue Number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| RNeasy mini spin column | Qiagen | 74106 | Included in RNeasy Mini Kit |
| Collection tubes (1.5 & 2 mL) | Qiagen | 74106 | Included in RNeasy Mini Kit |
| Buffer RLT | Qiagen | 74106 | Included in RNeasy Mini Kit |
| Buffer RW1 | Qiagen | 74106 | Included in RNeasy Mini Kit |
| Buffer RPE | Qiagen | 74106 | Included in RNeasy Mini Kit |
| RNase-free water | Qiagen | 74106 | Included in RNeasy Mini Kit |
| 14.3 M β-mercaptoethanol solution | Fisher Scientific | BP176100 | |
| 100% ethanol | Fisher Scientific | NC9602322 | |
| Vortex Genie 2, 120V | Scientific Industries | SI-0236 | |
| Taqman Influenza A Target 1 (Hydrolysis Probe) | Idaho Technologies | ASAY-ASY-0109 | |
| Lightcycler 20ml capillary tubes | Roche Applied Science | 04929292001 | |
| Micro-centrifuge with rotator for 2 ml tubes | Idaho Technologies | Included in RAPID kit | |
| Ruggedized Advanced Pathogen Identification Device (RAPID) 7200 | Idaho Technologies | Included in RAPID kit | |
| Pentium-based laptop with Windows XP Professional | Idaho Technologies | Included in RAPID kit | |
| Lightcycler Data Analysis software | Idaho Technologies | Included in RAPID kit |
References
- Spackman, E. Development of a real-time reverse transcriptase PCR assay for type A influenza virus and the avian H5 and H7 hemagglutinin subtypes. J Clin Microbiol. 40, 3256-3260 (2002).
- Takekawa, J. Y. Field detection of avian influenza virus in wild birds: evaluation of a portable rRT-PCR system and freeze-dried reagents. J Virol Methods. 166, 92-97 (2010).
- Das, A., Spackman, E., Senne, D., Pedersen, J., Suarez, D. L. Development of an internal positive control for rapid diagnosis of avian influenza virus infections by real-time reverse transcription-PCR with lyophilized reagents. J Clin Microbiol. 44, 3065-3073 (2006).
- Spackman, E., Suarez, D. L. Avian influenza virus RNA extraction from tissue and swab material. Methods Mol Biol. 436, 13-18 (2008).
- Chen, R., Holmes, E. C. Frequent inter-species transmission and geographic subdivision in avian influenza viruses from wild birds. Virology. , 383-3156 (2009).
- Macken, C. A., Webby, R. J., Bruno, W. J. Genotype turnover by reassortment of replication complex genes from avian influenza A virus. J Gen Virol. 87, 2803-2815 (2006).
- Dugan, V. G. The evolutionary genetics and emergence of avian influenza viruses in wild birds. PLoS Pathog.. 4, e1000076-e1000076 (2008).
- Spackman, E. Phylogenetic analyses of type A influenza genes in natural reservoir species in North America reveals genetic variation. Virus Res. 114, 89-100 (2005).
- Pasick, J. Advances in the molecular based techniques for the diagnosis and characterization of avian influenza virus infections.. Transbound Emerg Dis. 55, 329-338 (2008).
- . OIE Manual of diagnostics tests and vaccines for terrestrial animals (mammals, birds and bees). 1, 258-269 (2004).
- Weber, T. P., Stilianakis, N. I. Ecologic immunology of avian influenza (H5N1) in migratory birds. Emerg. Infect. Dis. 13, 1139-1143 (2007).
- Kim, J. -. K., Negovetich, N. J., Forrest, H. L., Webster, R. G. Ducks: the “Trojan Horses” of H5N1 influenza. Influenza and Other Respiratory Viruses. , 121-128 (2009).
- Gilbert, M. Flying over an infected landscape: distribution of highly pathogenic avian influenza H5N1 risk in South Asia and satellite tracking of wild waterfowl. Ecohealth. , (2010).
