مناعي لونين من الظهرية جذر الأنسجة العقد التالي من الإصابات محواري
Summary
نقدم طريقة للمناعي لونين من الجذر الظهراني الأنسجة العقد التالي محواري إصابة. ويمكن استخدام النهج لتحديد مواقع محددة ملزمة عامل النسخ والتعديل اللاجينية الهامة هيستون والحمض النووي للتجديد المحاوير بجروح في كل من الجهاز العصبي المحيطي والمركزي.
Abstract
المحاوير في الجهاز العصبي المركزي (CNS) لا تجديد في حين أن أولئك في الجهاز العصبي المحيطي (PNS) لا تتجدد على نطاق محدود بعد الاصابه (تنغ وآخرون ، 2006). فمن المسلم به أن يتم تنشيط البرامج الترانسكربتي ضرورية لنمو وneurite محواري عند الاصابة في الجهاز العصبي المحيطي (Makwana وآخرون ، 2005). إلا أن الأدوات المتاحة لتحليل الخلايا العصبية في الجسم الحي تنظيم الجينات محدودة وصعبة في كثير من الأحيان.
في العقد الجذرية الظهرية (DRG) تقدم نموذجا ممتازا إصابة النظام لأن معصب كلا من الجهاز العصبي المركزي والجهاز العصبي المحيطي من محوار متشعبة مصدره سوما نفسه. والعقد يمثل مجموعة متميزة من الهيئات الخلية حيث تحدث عن الأحداث النسخي ، وبالتالي توفير منطقة محددة بوضوح من النشاط الترانسكربتي التي يمكن بسهولة وإزالته من بتكاثر الحيوانات. وينبغي أن إصابة الألياف العصبية في الجهاز العصبي المحيطي (مثل العصب الوركي) ، حيث تجدد المحاور لم يحدث ، تكشف عن وجود مجموعة من برامج النسخ التي تختلف عن تلك الاستجابة لاصابة مماثلة في الجهاز العصبي المركزي ، حيث التجديد لا يأخذ مكانه (الحبل الشوكي على سبيل المثال ). ويمكن وصف مواقع لعامل النسخ ملزمة ، وتعديل هيستون الحمض النووي الناجم عن إصابة الجهاز العصبي المركزي أو الجهاز العصبي المحيطي إما باستخدام لونين مناعي (رقاقة).
هنا ، نحن تصف بروتوكول الشذرة الثابتة باستخدام الأنسجة DRG الماوس التالية محواري إصابة. هذا المزيج يوفر وسيلة قوية لتحديد خصائص بيئة لونين المؤيدة للتجديد اللازمة لتعزيز تجدد المحاور.
Protocol
Discussion
هذا البروتوكول يوفر طريقة مباشرة لنسأل عن البيئة خلال لونين محواري التجديد في الجهاز العصبي الكبار التالية محواري إصابة. اشتماله على نموذج إصابة DRG مع مناعي لونين للتحقيق في بيئة النسخي وجينية لاحقة للاصابة إما إلى الجهاز العصبي المحيطي أو الجهاز العصبي المركزي. ان?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نود أن نشكر اندريا تيديشي للمساعدة في تحديد التجارب الأولية الشذرة في المختبر ويندنر ريكو لمساهمته في تهذيب شروط الشذرة. وأيد هذا العمل من قبل مؤسسة Hertie ؛ المنحة فورتشن ، جامعة توبنغن ، ومنح دي DFG 1497/1-1 (منح جميع لسيمون دي جيوفاني).
Materials
| Reagent | Company | Catalogue number |
|---|---|---|
| 10x ChIP Buffer | Cell Signaling | 7008 |
| 2x ChIP Elution Buffer | Cell Signaling | 7009 |
| ChIP Grade Protein G Magnetic Beads | Cell Signaling | 9006 |
| Magna Grip Rack (8 well) | Millipore | 20-400 |
| Chloroform | MERCK | UN 1888 |
| 37% Formaldehyde | ROTH | CP10.1 |
| 10x Glycine Solution | Cell Signaling | 7005 |
| Glycogen | Sigma | G1767 |
| 10x HBSS | Gibco | 14185 |
| Histone H3 antibody (rabbit) | Cell Signaling | 2650 |
| Normal Rabbit IgG | Cell Signaling | 2729 |
| Phenol/Chloroform/Isoamyl Alcohol | ROTH | A156.1 |
| Protease Inhibitors Cocktail Tablets | Roche | 04 693 116 001 |
| Proteinase K (20 mg/ml) | Cell Signaling | 10012 |
| SDS Lysis Buffer | Upstate | 20-163 |
| Equipment needed |
|---|
| Sonicator |
| Micropestle |
| Microcentrifuge |
| Thermomixer |
References
- Beirowski, B. Quantitative and qualitative analysis of Wallerian degeneration using restricted axonal labelling in YFP-H mice. Journal of Neuroscience Methods. 134, 23-35 (2004).
- Carey, M. F. . Chromatin immunoprecipitation (ChIP). , (2009).
- Dahl, J. A. A rapid micro chromatin immunoprecipitation assay (μChIP. Nat. Protoc. 3, 1032-1045 (2008).
- Haring, M. Chromatin immunoprecipitation: optimization, quantitative analysis and data normalization. Plant Methods. 11, 3-11 (2007).
- Jiang, Y. Isolation of neuronal chromatin from brain tissue. BMC Neurosci. 9, 42-42 (2008).
- Lee, A. Isolation of neural stem cells from the postnatal cerebellum. Nat Neurosci. 8, 723-729 (2005).
- Makwana, . Molecular mechanisms in successful peripheral regeneration. Febs J. 272, 2628-2638 (2005).
- Tedeschi, A. A p53-CBP/p300 transcription module is required for GAP-43 expression, axon outgrowth, and regeneration. Cell Death and Differentiation. 16, 543-554 (2009).
- Teng, F. Y. Axonal regeneration in adult CNS neurons–signaling molecules and pathways. J Neurochem. 96, 1501-1508 (2006).
