Изотермические калориметрия титрования для измерения Макромолекулярно-лиганд Affinity

Изотермические калориметрии титрования (МТЦ) является хорошо организованной техника, которая может определить все термодинамические параметры (близость, энтальпии и стехиометрии) обязательного взаимодействия в одном эксперименте 1. МТЦ работает титрованием одного реагента во второй реагент в изотермических условиях. Сигнал измеряется тепла, выделяемого или поглощаемого при взаимодействии (обязательные) двух реагентов. Серии инъекций выполняются и тепла сигнал будет стремиться к нулю как предельный реагентов становится насыщенным. Монтаж изотермы дает термодинамических параметров. Несколько обзоров доступны, которые описывают приборов, а также математику сбора и анализа данных. 2,3 то время как другие калориметров доступны (в первую очередь ЦМТ 200 с небольших объемах), то здесь мы опишем общий протокол для VP-ITC производства по MicroCal (теперь часть компании GE Healthcare). 1. Подготовка образцов Для того чтобы подготовить макромолекулы и лиганда в буфер, некоторые потенциальные проблемы должны быть решены. Точная подходит требуют правильной концентрации макромолекул, видов, которые обычно идет в образце ячейки ЦМТ, и лиганд, видов в инъекции шприцем. Потому что некоторые белки совокупности не высокой концентрации, необходимой для вида в инъекции шприцом, чаще всего белок загружается в кюветы. Оптимальная концентрация макромолекул определяется "с", продукт предсказал близость системы, которая может быть оценена с помощью ортогональных методов перед использованием ЦМТ, и суммарная концентрация макромолекул, где с = K * [M]. Оптимальные значения диапазона с от 10-1000, 1, хотя можно получить точные данные для слабой связи в соответствии с конкретными экспериментальных условиях с с-значения ниже нижнего предела. 4 Таким образом, макромолекулы концентрация должна быть определена с этого диапазона с значениями в виду (т. е. для K 10 6 М -1, макромолекулы концентрациях от 10 до 1000 мкМ должны использоваться). До знание сродство системы могут помочь свести к минимуму белка, используемого для ЦМТ за счет улучшения дизайна эксперимента ЦМТ. Концентрация лиганда должна быть достаточно большой (7-25 раз более концентрированным, чем K сут в течение слабое связывание лигандов сайта), так что насыщение происходит в течение первой трети до половины титрования. Точная подгонка данных также требует насыщения сигнала. Для систем с более высоким сродством, ниже концентрации лиганда следует использовать, чтобы избежать насыщения слишком рано титрования, который даст неточные подходит. Как только тепло разведения контроля (т.е. титрования лиганда в буфер) был вычтен из титрования, энтальпии при насыщении должна стремиться к нулю. Поскольку малые молекулы примесей может привести к искусственной сигналов в ЦМТ измерений, лучше всего, если это возможно, что макромолекулы и лиганд исчерпывающе диализу против буфера. Кроме того, колоночной хроматографии, обессоливания спина колонны, или буфер обмена центробежные фильтры (например, Centricons) может быть использована для изменения буфера макромолекулы. Если лиганд маленькая молекула, она может быть получена с использованием буфера после диализа макромолекула была диализу или диализа против диализных мембран с отключений подходит для небольших молекул (т. е. 100-500 Da для Спектра / Пор-Float-Lyzer ). Различия в буфере состава между лигандом и макромолекулы решения могут привести к артефактов сигнала от высокой температуры разбавление примесей в образцах. После подготовки, проверить, чтобы убедиться, рН матча буфера, макромолекулы и лиганда (± 0,05 единиц рН), а артефакты в энтальпии может возникнуть из-за буфером протонирования эффектов. 5 Убедитесь, подготовить достаточное количество каждого вида. Для трех экземплярах экспериментов и разведения контроля расхода материала, требующегося будет зависеть от МТЦ используется. Однако, для большинства ЦМТ инструменты, которые имеют приблизительный 2 мл клетки объем образца, по крайней мере 6-7 мл макромолекулы решение будет необходимо, и может быть удобно, подготовленный в 15 мл пробирки сокола. Для 300 мкл шприцы, 1-2 мл раствора должна быть адекватной, и могут быть получены либо в трубах сокола или микроцентрифужных труб. Пыль и другие частицы, может привести к появлению артефактов в базовой термограммы ЦМТ. Крайне важно, чтобы они были удалены перед запуском эксперимента. После приготовления растворов образцов состава, образцы должны быть центрифугируют в микроцентрифужных труб в течение пяти минут при 8000 до 14000 RPM для осаждения частиц в растворе. Удалить супернатант, стараясь не потревожить осадок, и поместить его в новое сокола / микроцентрифужных трубки. Если восстановителей необходимы для поддержания снижается цистеина, использование низких концентрациях и свежие запасы β-Меркаptoethanol, TCEP (трис (2-карбоксильная) фосфин) или дитиотреитол чтобы свести к минимуму артефакты из-за окисления восстановителя. Кроме того, наличие органических растворителей в буфер (общие для некоторых малых лигандов молекулу, которая, возможно, потребуется метанол или ДМСО, чтобы быть растворимым) могут послужить причиной артефактов. Если органические растворители, которые необходимы для лигандов, то макромолекулы решение должно также содержать такой же концентрации, чтобы избежать какой-либо сигнал, возникающие от теплового разбавления органического растворителя. Незначительные различия в буфере состава между лигандом и макромолекулы связи с растворители, соли или рН возможны в процессе подготовки образцов. Лучше всего, чтобы проверить разбавления лиганда в буфере образца или образца буфера в макромолекулы, чтобы тепло сигналов, возникающих из-за разницы в содержимое буфера не вызывают данные, вытекающие исключительно из артефактов. Проверка концентрации макромолекул и лиганда тщательно с использованием методов, подходящей для вашей системы (например, поглощение измерений, ВЭЖХ, колориметрические анализы, анализы BCA для белков и т.д.), чтобы записать их точные концентрации. Различия в фактической концентрации и концентрации используется для подбора изотермы будет приводить к ошибкам в стехиометрии, энтальпии и сродство определяется из эксперимента. Оно является общим для дегазации образцов, чтобы избежать артефактов сигнала из-за пузырьков воздуха или освобождения от растворенных газов во время титрования, особенно при более высоких температурах. 2. Настройка эксперимента Убедитесь, что ячейка образца и инъекции шприцем уборка в соответствии с протоколом производителя до загрузки макромолекулы и лиганда. Промойте кювету два или три раза с 1,8 мл дистиллированной воды, используя шприц Гамильтон (соблюдайте меры предосторожности со шприцем Гамильтон, как ствол легко ломается или иглы согнуты). Следующая промыть кювету несколько раз с 1,8 мл буфера. Нагрузка кювету с 1,8 мл макромолекулы решение, соблюдая осторожность, чтобы избежать образования пузырьков. Заполните ссылкой на ячейку дистиллированной водой. Для большинства буферов, дистиллированная вода прекрасно использовать в качестве раствора сравнения. Тем не менее, для буферов с особенно высокой ионной силой или осмоляльности, то лучше использовать буфер в виде ссылки. Удалить пузырьки воздуха из ссылки и образцы клеток с использованием шприца Гамильтона. Аккуратно переместите иглу шприца вверх-вниз по сторонам ячейки стучится пузыри, которые могут быть на дне клетки и придает хорошо верхней части ячейки. Удалите излишки объемом от образцов и эталонов клеток. Прикрепите пластиковый шприц, чтобы заполнить порт инъекции шприцем использованием трубки. Промыть инъекции шприц с дистиллированной водой. Следуйте на буфер полоскания. Убедитесь, что инъекции шприцем полностью эвакуированы, рисуя воздух через систему. Место иглу шприца в инъекции лиганд решение и сделать лиганд раствора в шприце инъекции, пока весь шприц полном объеме. Продолжить рисунок немного избыточного объема (примерно 50 мкл и более) в порт и придает труб. Немедленно закройте заполнить порт шприц и снимите трубку и пластиковый шприц. Чистки и пополнить инъекции шприцем еще два раза, чтобы удалить пузырьки из шприца. Удалите шприц с лигандом решение и протрите бок с kimwipe удалять любые капли, стараясь не касаться наконечника шприца для kimwipe так как это может удалить объемом от шприца. Кроме того, будьте осторожны, чтобы не стучать или банку шприцем, как это также может привести к потере объема от наконечника шприца. Место инъекции шприцем в образец клеток. Настройка параметров для работы ЦМТ. Для связывания систем с сильными сигналами тепла, большое количество низких инъекций объеме даст больше точек данных для установки (например, 75 инъекций 3 мкл). Для систем, которые имеют слабые сигналы тепло, небольшое количество крупных инъекций объема предпочтительнее (например, 33 инъекций 8 мкл). Чаще всего, меньшее количество инъекций с более высокими объемами инъекции используются. Это может занять несколько титрования оптимизировать условия, которые лучше всего подходят для вашей системы. Важно отметить, что обязательным энтальпии может быть либо экзотермических или эндотермических, в зависимости от изучаемой системы. К сожалению, некоторые системы имеют низкую сигналы тепла, что делает тепловой эффект реакции трудно определить. Проблемы с такими системами, потенциально могут быть преодолены за счет увеличения концентрации макромолекул, изменение температуры опыта (в зависимости от теплоемкости обязательной системы), и / или изменении рН или ионной силы буфера. Также учитывать время расстояние между каждой инъекции. Крайне важно, чтобы после каждой инъекции лиганда, системы дается время, чтобы уравновесить и тепла сигнал возвращается к исходному уровню до начала следующей инъекции происходит. Для большинства систем от трех до пяти мильnutes должна быть адекватной. Времени между инъекциями должны быть увеличены для систем, где равновесие не наступает в течение пяти минут. Потому что там будут какие-то смешивание между макромолекулой и лигандом решения в инъекции шприцом, когда он будет вставлен в кюветы, первая инъекция даст ложные результаты. Лучше всего использовать небольшие объемы (например, 2 мкл) в течение первых одного или двух инъекций (так что они в дальнейшем могут быть уничтожены) и сохранить последующие инъекции на требуемые значения. Выберите температуру эксперимента (с 25 ° С является наиболее распространенным, хотя и температуре от 2 до 80 ° C могут быть использованы). Лучше всего выбирать температуру, соответствующую других экспериментах (связывание, кинетика и т.д.) осуществляется на лиганд-макромолекулы системы. МТЦ может быть настроен для уравновешивания при температуре, отличной от температуры эксперимента. Если эксперимент будет проводиться при температуре более 10 ° С от комнатной температуры, то лучше установить равновесие температур для прибора в пределах 5 ° С от температуры опыта. Это позволит сократить время прибор будет достичь температуры эксперимента. Перемешивании скорость шприц также необходимо учитывать. Перемешивание, необходимых для надлежащего смешивания лиганда и макромолекулы во время титрования, но некоторые белки дестабилизирована быстром перемешивании. Для этих случаев, скорости перемешивания должна быть установлена ​​на относительно низком уровне. После того как все параметры эксперимента были созданы, то эксперимент может быть запущен. Как только эксперимент закончен, ИТЦ могут быть очищены в соответствии с протоколом производителя. Раствор в кювету в конце эксперимента могут быть сохранены, если дополнительные эксперименты на макромолекулы-лиганд смеси лучшего. Повторите титрование по крайней мере один или два раза, чтобы получить воспроизводимые данные. Выполнить контроля, где лиганд титруют в буфер в кювету для определения теплоты разбавления для лиганда. Для некоторых систем, где есть совместные обязательными, дополнительную информацию о процессе привязки может быть получен путем введения в макромолекулу лиганда. Различной ориентации инъекции могут дать дополнительную информацию, которая может быть полезной для глобальной установки 6. 3. Анализ данных Монтаж данные могут быть легко осуществляется с помощью макросов в какие-либо данные установки программы (обычно поставляемых производителем вместе с прибором). Нагрузка Первый файл данных. Проверка сырья термограммы для каких-либо признаков пузырьки воздуха или других артефактов сигнала. Если Есть каких-либо артефактов (например, шипы в базовом или пики, когда не было инъекции в тот момент времени), то обратите внимание на следующие точки данных, как они должны быть удалены. Далее, нагрузка лиганд данных разбавления контроля, и вычесть лиганд разбавления данные из обязательных изотермы. На этот раз, удалите все точки ложные данные, в том числе одну или две данные точки титрования, где разведение артефакты происходят (см. шаг 7). Выберите данные установки модели (один сайт связывания, две / несколько сайтов связывания, кооперативного связывания, и т.д.), которые будут использоваться в соответствии с данными. Данные могут быть пригодны с начальными догадками из подгоночных параметров, стехиометрии (п), энтальпии (ΔH) и сродство (К). Если предварительное знание сродство или других параметров, известно из ортогональных экспериментов, то эти значения могут быть введены. Это помогает избежать подходят становится в ловушке локальных минимумов во время примерки. После того как данные были пригодны для первого титрования, повторите шаги 15 и 16 для остальных изотерм. Кроме того, данные могут быть в форме разных стран, используя такие программы, как SEDPHAT 6. SEDPHAT может быть особенно полезным в глобальную установку двойных комплексных наборов данных (т.е. молекул A + B) в сочетании с тройной сложные наборы данных (молекулы A + B + C). Например, в связывании молекулы С до комплекса AB, это не всегда ясно, будет ли там может быть любой сигнал из-за привязки к C или B, чтобы (если не полностью насыщенный). Чтобы убедиться, что ЦМТ данные не искусственной, сродство и стехиометрии получена из ЦМТ следует сравнивать с ортогональным методом. 7,8 Кроме того, стоимость ITC энтальпии можно сравнить с энтальпии от участка Вант-Гофф 9. Она также может оказаться полезным для использования различных концентраций лиганда или макромолекулы как абсолютная величина теплового сигнала должна возрастать с увеличением концентрации макромолекул. Артефакты чаще всего возникают, если буферы в клетке и шприцев не совпадают. Еще одна возможность для артефактов возникает из нечистых образцов. Мы рекомендуем, чтобы пользователю начать с простых двойных комплексных титрования, для которого существует предыдущая информация доступна на К д и stoichiometry. Тогда, если дополнительные лиганды связываются, пользователь может попробовать более сложные титрования тройной комплекс, варьируя концентрацию лигандов, и, возможно переключение шприц и клеточных компонентов. Сравнение энтальпий для обоих путей к тройной комплекс образование должно быть как добавка энтальпия государственной функции. 10 Опять же, SEDPHAT 6, вероятно, будет весьма полезно здесь. 4. Представитель Результаты: Рисунок 1. Типичный пример хорошо себя титрования для связывания кофактора НАДФН к Е. кишечной хромосомных дигидрофолатредуктазы (ecDHFR). Панель () показывает, сырье термограммы; (В), обязательными изотерма из интегрированной подходят термограмма использованием одной модели сайта, в происхождении программного обеспечения, и (C) соответствуют изотермы использованием одна модель привязки сайта из SEDPHAT вместе с соответствуют остатков. От происхождения программного обеспечения, с помощью одного сайта моделью привязки, п = 1,09 ± 0,02, К г = 0,194 ± 0,001 мкМ, ΔH = -22,7 ± 0,4 ккал / моль, TΔS = -13,1 ± 0,4 ккал / моль, а ΔG = – 9,16 ± 0,01 ккал / моль. Приступы данных с использованием Sedphat себе п 0,94 ± 0,01, К сут 0,195 ± 0,013 Ат, ΔH от -22,5 ± 0,2 ккал / моль, TΔS от -13,39 ккал / моль, а ΔG от -9,15 ккал / моль.