Ex Vivo Cultuur van primaire menselijke eileider epitheelcellen
Summary
De eileider (FT) is in opkomst als een alternatieve site van oorsprong voor de sereuze ovariumcarcinoom (SOC). Dit protocol beschrijft een nieuwe methode voor de isolatie en<em> Ex vivo</em> Cultuur van de eileider epitheliale cellen. Dit systeem recapituleert de<em> In vivo</em> Epitheel en laat de studie van de SOC pathogenese.
Abstract
Epitheliale eierstokkanker is een belangrijke oorzaak van kanker bij vrouwen de sterfte in de Verenigde Staten. In tegenstelling tot andere vrouwen-specifieke vormen van kanker, zoals borst-en baarmoeder carcinomen, waar de dood is gedaald in de afgelopen jaren hebben eierstokkanker genezingspercentages bleef relatief onveranderd de afgelopen twee decennia een. Dit is grotendeels te wijten aan het gebrek aan de juiste screening tools voor detectie van vroege stadium van de ziekte, waar een operatie en chemotherapie zijn het meest effectief 2, 3. Als gevolg daarvan, de meeste patiënten aanwezig met gevorderd stadium van de ziekte en diffuse abdominale betrokkenheid. Dit wordt verder bemoeilijkt door het feit dat kanker van de eierstokken is een heterogene ziekte met meerdere histologische subtypes 4, 5. Sereuze ovariumcarcinoom (SOC) is de meest voorkomende en agressief subtype en de vorm die het meest vaak geassocieerd met mutaties in de BRCA genen. Huidige experimentele modellen in dit gebied gekenmerkt door het gebruik van kanker cellijnen en muismodellen beter inzicht in de genetische gebeurtenissen initiëren en pathogenese van de ziekte 6, 7. Onlangs heeft de eileider naar voren als een nieuwe site voor de oorsprong van de SOC, met de eileider (FT) secretorische epitheliale cel (FTSEC) als de voorgestelde cel van oorsprong 8, 9. Er zijn momenteel geen cellijnen of cultuur ter beschikking van de FT epitheel of de FTSEC studie. Hier beschrijven we een nieuwe ex vivo cultuur systeem waar primaire menselijke FT epitheliale cellen worden gekweekt op een manier die hun architectuur, polariteit, immunofenotype, en de respons op fysiologische en genotoxische stressoren behoudt. Deze ex vivo model biedt een nuttig instrument voor de studie van SOC, waardoor een beter begrip van hoe tumoren kunnen ontstaan uit dit weefsel, en de mechanismen die betrokken zijn in de tumor initiatie en progressie.
Protocol
Discussion
De identificatie van de FT als kandidaat plaats van oorsprong voor SOC biedt de mogelijkheid voor fundamenteel en translationeel onderzoek gericht op het ontcijferen van de mechanismen die het koppelen van bekende risicofactoren en de werkelijke sereuze kankerverwekkend proces. Kritiek voor dit is de ontwikkeling van soepel model systemen die ons in staat stelt om te beginnen met het testen van de hypothese dat de FTSEC is een cel-van-oorsprong bekken sereuze carcinomen. De ex vivo cultuur model hierin beschreven is een nieuw systeem dat de isolatie en de co-cultuur van de primaire FT secretoire en trilharen cellen maakt op een manier die de morfologie en biologie van de inheemse FT epitheel bewaart. Met behulp van dit systeem, hebben we onlangs gekarakteriseerd de secretoom van dit epitheel en de manier waarop het epitheel reageert op mechanische en genotoxische letsels 10. Ovulatie, een belangrijke risicofactor in verband met eierstokkanker ontstaan van tumoren, wordt gekenmerkt door een combinatie van weefselbeschadiging, ontstekingsmediatoren, groeifactoren, hormonen en 11. Dit systeem kan worden gebruikt om het effect van een ovulatie milieu van de reacties en levensvatbaarheid van secretorische en trilharen cellen te bestuderen. Bovendien kan de invloed van andere celtypes (dat wil zeggen ontstekingscellen) worden onderzocht om een beter begrip van de gebeurtenissen toestaan dat rijden cel-type differentiatie en de factoren die bijdragen aan de neoplastische transformatie van deze cellen. Vergelijkbare modellen zijn beschreven in andere weefsels waar gepolariseerde epitheel aanwezig is. Bijvoorbeeld, in gepolariseerde primaire culturen van luchtwegepitheel, werd het effect van hereguline op de celgroei en de respons op cellulair letsel beoordelen 12. Deze types van model systemen bieden een nieuwe en handige manier om de initiatie en pathogenese van tumoren die ontstaan uit epitheliale weefsels te bestuderen, en dit is van cruciaal belang in weefsels zoals de FT, waar geen enkele cellijnen bestaan momenteel, en waar er een grote nodig voor de identificatie van de belangrijkste wegen en de ontwikkeling van nieuwe behandelingsstrategieën.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken de faculteit, jongens, bewoners, en arts-assistenten van het Brigham and Women's Hospital, afdeling Pathologie voor het maken van weefsel beschikbaar is voor deze studies. Dit werk werd ondersteund door subsidies voor onderzoek van de NIH / National Cancer Institute (P50 CA105009, K08 CA108748, U01 CA152990), Ovarian Cancer Research Fund, The May Kay Foundation, Novartis Pharmaceuticals, Robert en Deborah eerste fonds, Randi en Joel Cutler Ovariumcarcinoom Research Fund, Marsha Rivkin Foundation – Scientific Scholar Award, AACR – George en Patricia Sehl Fellowship for Cancer Research Genetica, en de Amerikaanse Arts Fellowship voor Geneeskunde in Israël – Claire en Emmanuel G. Rosenblatt Foundation Grant.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Collagen from human placenta (Bornstein and Traub Type IV) | Sigma | C7521 | ||
| DMEM:F12 media | Cellgro | 15-090-CV | ||
| Ultroser G | Crescent Chemical Company | 67042 | Add 20 ml of DMEM:F12 to stock bottle and use 10mls per 500 ml of media (2% final concentration) | |
| Pen Strep | Invitrogen | 15140-122 | ||
| BD Primaria culture plates | BD Bioscience | 353802 | ||
| 24 well Transwell Permeable supports | Corning (Costar) | 3470 | Clear, 6.5 mm insert, 0.4 μm pore size, treated polyester | |
| MEM (Minimal Essential Media) | Cellgro | 10-010-CV | ||
| Pronase | Roche | 11459643001 | ||
| DNAse | Sigma | DN25 | ||
| Sall2 antibody | Dr T. Benjamin, Harvard | Gift | 1:20 dilution | |
| Pax8 antibody | Proteintech | 10336-1-AP | 1: 1000 dilution |
References
- Jemal, A., Siegel, R., Xu, J., Ward, E. Cancer statistics. CA Cancer J. Clin. 60, 277-300 (2010).
- Markman, M., Walker, J. L. Intraperitoneal chemotherapy of ovarian cancer: a review, with a focus on practical aspects of treatment. J. Clin. Oncol. 24, 988-994 (2006).
- Liu, J., Matulonis, U. A. New advances in ovarian cancer. Oncology (Williston Park). 24, 721-728 (2010).
- Cannistra, S. A. Cancer of the ovary. N. Engl. J. Med. 351, 2519-2529 (2004).
- Kurman, R. J., Shih, I. M. The origin and pathogenesis of epithelial ovarian cancer: a proposed unifying theory. Am. J. Surg. Pathol. 34, 433-443 (2010).
- Fong, M. Y., Kakar, S. S. Ovarian cancer mouse models: a summary of current models and their limitations. J Ovarian Res. 2, 12-12 (2009).
- Shan, W., Liu, J. Epithelial ovarian cancer: focus on genetics and animal models. Cell Cycle. 8, 731-735 (2009).
- Levanon, K., Crum, C. P., Drapkin, R. New insights into the pathogenesis of serous ovarian cancer and its clinical impact. J. Clin. Oncol. 26, 5284-5293 (2008).
- Karst, A. M., Drapkin, R. Ovarian cancer pathogenesis: a model in evolution. J Oncol. 2010, 932371-932371 (2010).
- Levanon, K., Ng, V., Piao, H. Y., Zhang, Y., Chang, M. C., Roh, M. H., Kindelberger, D. W., Hirsch, M. S., Crum, C. P., Marto, J. A., Drapkin, R. Primary ex vivo cultures of human fallopian tube epithelium as a model for serous ovarian carcinogenesis. Oncogene. 25, 1103-1113 (2010).
- Landen, C. N., Birrer, M. J., Sood, A. K. Early events in the pathogenesis of epithelial ovarian cancer. J. Clin. Oncol. 26, 995-1005 (2008).
- Vermeer, P. D., Einwalter, L. A., Moninger, T. O., Rokhlina, T., Kern, J. A., Zabner, J., Welsh, M. J. Segregation of receptor and ligand regulates activation of epithelial growth factor receptor. Nature. 422, 322-326 (2003).
