세포 독성 T Lymphocytes에 의해 베타 세포 죽음의 중재를 평가하는 방법
Summary
셀 – 중재의 lymphocytotoxicity (CML) assays는 체외에서 autoreactive 반응 및 세포 사망의 학습 메커니즘을 테스트하는 데 사용할 수 있습니다. 그러나, 형광 염료, 타입 및 세포 죽음뿐만 아니라 활용 경로의 반응 속도론 살 세포 공촛점 미세한 이미징 기술을 사용하여 더 자세히 공부하실 수 있습니다.
Abstract
제 1 형 당뇨병 (T1D)는 T 세포 매개 면역 질환이다. 인슐린 생산이 분실로 pathogenesis 동안, 환자는 T 세포에 의해 췌장 베타 세포의 파괴에서 아마도이 결과는 점차적으로 더 insulinopenic됩니다. T1D의 개발 기간 동안 베타 세포 죽음의 메커니즘을 이해하는 것은이 질병에 대한 효과적인 치료를 생성하는 통찰력을 제공할 것입니다. 셀 – 중재 lymphocytotoxicity (CML) assays는 역사적으로 대상 세포를 레이블 radionuclide 크롬 51 (51 CR) 사용하고 있습니다. 이러한 목표는 다음 효과기 세포에 노출되고 대상 세포에서 51 피크의 릴리스는 림프구 – 중재 세포의 죽음은 표시대로 읽습니다. 51 피크의 감소 릴리스에서 세포 사망 결과의 억제제.
효과기 세포, 우리는 CD8의 활성화 autoreactive clonal 인구 + 알파 및 AI4 T 세포 수용체 (TCR)의 베타 체인 모두에 대해 마우스 재고 유전자 변형으로부터 격리 세포 독성 T의 lymphocytes (CTL)을 사용합니다. 활성 AI4 T 세포는 16 시간 동안 51 피크 표시 대상 NIT 세포와 공동 교양 있었다, 51 릴리스는 피크는 특정 용해를 계산하기 위해 기록된
Mitochondria 같은 에너지 생산, 전달 시그널링 규제 및 apoptosis 등 많은 중요한 생리 이벤트에 참여할 수 있습니다. T1D의 개발 기간 동안 베타 세포 mitochondrial 기능 변화의 연구는 연구의 소설 공간입니다. mitochondrial 막 잠재적인 염료 Rhodamine Tetramethyl 메틸 에스테르 (TMRM)와 공촛점 미세한 라이브 셀 이미징을 사용하여, 우리는 베타 세포 라인 NIT – 1에서 시간이 지남에 따라 mitochondrial 막 잠재력을 감시. 이미징 연구, 효과기 AI4 T 세포는 형광 염색법 핵 염색 Picogreen으로 표시되었습니다. NIT – 1 세포와 T 세포가 chambered coverglass 공동 교양과 라이브 셀 챔버가 장착된 현미경 무대에 장착된 37에 지배되었다 ° C 5 % CO 2, humidified와 함께. 이러한 실험을하는 동안 이미지는 각 클러스터의 400 분 동안 매 3 분 촬영했다.
400분의 과정 동안, 우리는 AI4 T 세포가 첨부되었습니다 NIT – 1 셀 클러스터의 mitochondrial 막 잠재력의 낭비를 관찰했다. NIT – 1 세포가 MHC와 함께 공동 교양 있던 동시 제어 실험에 잘못이 검색 인간 림프구 Jurkat 세포를 mitochondrial 멤브레인 가능성은 온전하게 남아 있어요. 이 기술은 세포 독성 lymphocytes, 크린 시토킨 또는 다른 세포 독성 시약의 공격을 받고 세포 mitochondrial 막 잠재력에 실시간으로 변경 사항을 관찰하는 데 사용할 수 있습니다.
Protocol
Discussion
세포 독성 T 세포 매개 베타 세포 죽음은 T1D 5 주 pathophysiology입니다. 51 피크 자료를 사용하여 CML의 assays은 우리가 효과기 – 목표 응답 6 정도를 공부하실 수 있습니다. 그러나, 세부적인 프로세스 및 T 세포 – 매개 베타 세포 사망 경로는 아직도 완전히 이해되지 않습니다. mitochondria가 베타 세포 기능과 사망 7 중요하기 때문에, 우리는 시각 CML 동안 mitochondrial 변?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 건강 DK074656 및 AI56374 (CEM)의 국립 연구소에서 보조금뿐만 아니라, 소아 당뇨병 연구 재단에 의해 지원되었다.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| Cr-51 | Perkin Elmer | NEZ030500IMC | |
| PBS | Cellgro | 21-040-60 | |
| Tetramethyl Rhodamine Methyl Ester (TMRM) | Invitrogen | T668 | |
| Picogreen | Invitrogen | P7581 | |
| AI4 mimotope | mimotopes.com | amino acid sequence: YFIENYLEL | |
| IL-2 | R & D | 485-MI | |
| DMEM | Invitrogen | 11885 | |
| FBS | HyClone | SH30071.03 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A8412 | |
| HEPES | Cellgro | 25-060-Cl | |
| MEM Non-Essential Amino Acids | GIBCO | 11140 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gemini | 400-109 | |
| Phenol red-free DMEM | Sigma | D5303 | |
| CO2 Incubator | Thermo Fisher | HeraCell 150i | Kept sterile for cell culture |
| Biological safety cabinet | Thermo Fisher | Forma 1440 | |
| Disposable culture tubes, 6×50 mm Lime Glass | Fisher | 14-958-A | |
| Gamma Counter | Perkin Elmer | Wizard 1470 Automatic Gamma Counter | |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM 510 Meta Confocal | With motorized stage and live cell chamber |
| Pipette (1ml, 200μl, 20μl,10μl, 2μl) | Eppendorf | ||
| Tubes (Amber) | Fisher | 50819772 | |
| Centrifuge | Sorvall Legend RT+ | 75004377 | |
| Hemacytometer | Fisher Scientific | 267110 | |
| Upright Microscope | Zeiss | Axioskop40 | |
| NOD.Cg-Rag1tm1Mom Tg(TcraAI4)1Dvs/DvsJ Mice | The Jackson Laboratory | 004347 | |
| NOD.Cg-Rag1tm1Mom Tg(TcrbAI4)1Dvs/DvsJ Mice | The Jackson Laboratory | 004348 | |
| NOD-AI4α/ β F1 mice | N/A | N/A | Bred in UF animal facility |
References
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