Métodos para evaluar la Beta mediada por la muerte celular por linfocitos T citotóxicos
Summary
Mediadas por células linfocitotoxicidad (LMC) los ensayos se pueden utilizar para evaluar las respuestas autorreactivas y los mecanismos de estudio de la muerte celular in vitro. Sin embargo, utilizando células vivas, las técnicas de microscopía confocal microscópicos con tintes fluorescentes, el tipo y la cinética de muerte celular, así como las rutas utilizadas se pueden estudiar con mayor detalle.
Abstract
La diabetes tipo 1 (DT1) es una enfermedad mediada por células T autoinmunes. Durante la patogénesis, los pacientes se vuelven cada vez más insulinopenia como la producción de insulina se pierde, probablemente esto se debe a la destrucción de las células beta del páncreas por las células T. Comprensión de los mecanismos de la muerte de las células beta en el desarrollo de DT1 proporcionará información para generar una cura efectiva para esta enfermedad. Mediada por células linfocitotoxicidad (LMC) los ensayos se han utilizado históricamente el radionúclido cromo 51 (51 Cr) para etiquetar las células diana. Estos objetivos se exponen a las células efectoras y la liberación de 51 Cr de las células diana se lee como una indicación de la muerte celular mediada por linfocitos. Los inhibidores de la consecuencia de muerte celular en menor liberación de 51 Cr.
Como células efectoras, se utilizó una población activa autorreactivos clonal de las células CD8 + linfocitos T citotóxicos (CTL) aislado de un ratón transgénico de valores, tanto para las cadenas alfa y beta del receptor de la célula AI4 T (TCR). Activa las células T AI4 fueron co-cultivadas con 51 Cr células diana marcadas NIT durante 16 horas, la liberación de 51 Cr se registró para el cálculo de lisis específica
Las mitocondrias participar en importantes eventos fisiológicos, tales como la producción de energía, la regulación de la transducción de señales, y la apoptosis. El estudio de las células beta mitocondrial cambios funcionales durante el desarrollo de DT1 es una nueva área de investigación. Utilizando el potencial de membrana mitocondrial colorante tetrametil rodamina éster metílico (TMRM) y confocal de imágenes microscópicas de células vivas, que supervisó el potencial de membrana mitocondrial en el tiempo en la línea de células beta NIT-1. Para los estudios de imagen, las células T efectoras AI4 fueron marcadas con el colorante fluorescente tinción nuclear Picogreen. NIT-1 en las células y las células T fueron co-cultivadas en cubreobjetos y cámaras montadas en la platina del microscopio equipado con una cámara de células vivas, controlada a 37 ° C, con 5% de CO 2, y húmedo. Durante estos experimentos se tomaron imágenes de cada grupo cada 3 minutos durante 400 minutos.
Más de un curso de 400 minutos, se observó la disipación del potencial de membrana mitocondrial en NIT-1, donde grupos de células AI4 las células T se adjunta. En el experimento de control simultáneo donde NIT-1 células fueron co-cultivadas con MHC mal emparejado las células Jurkat de linfocitos, el potencial de membrana mitocondrial se mantuvo intacta. Esta técnica se puede utilizar para observar en tiempo real los cambios en el potencial de membrana mitocondrial en las células bajo el ataque de los linfocitos citotóxicos, citocinas u otros reactivos citotóxicos.
Protocol
Discussion
Células T citotóxicas mediadas por muerte de las células beta es la fisiopatología principal de DT1 5. Ensayos de CML con 51 Cr liberación nos permite estudiar el grado de respuesta del efector objetivo 6. Sin embargo, el proceso detallado y las vías de las células T mediada por la muerte de las células beta aún no está totalmente entendido. Dado que las mitocondrias son esenciales para la función celular beta y la muerte de siete, nos hemos centrado en cambios en l…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por becas de los Institutos Nacionales de Salud y DK074656 AI56374 (CEM), así como la Fundación de Investigación de Diabetes Juvenil.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| Cr-51 | Perkin Elmer | NEZ030500IMC | |
| PBS | Cellgro | 21-040-60 | |
| Tetramethyl Rhodamine Methyl Ester (TMRM) | Invitrogen | T668 | |
| Picogreen | Invitrogen | P7581 | |
| AI4 mimotope | mimotopes.com | amino acid sequence: YFIENYLEL | |
| IL-2 | R & D | 485-MI | |
| DMEM | Invitrogen | 11885 | |
| FBS | HyClone | SH30071.03 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A8412 | |
| HEPES | Cellgro | 25-060-Cl | |
| MEM Non-Essential Amino Acids | GIBCO | 11140 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gemini | 400-109 | |
| Phenol red-free DMEM | Sigma | D5303 | |
| CO2 Incubator | Thermo Fisher | HeraCell 150i | Kept sterile for cell culture |
| Biological safety cabinet | Thermo Fisher | Forma 1440 | |
| Disposable culture tubes, 6×50 mm Lime Glass | Fisher | 14-958-A | |
| Gamma Counter | Perkin Elmer | Wizard 1470 Automatic Gamma Counter | |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM 510 Meta Confocal | With motorized stage and live cell chamber |
| Pipette (1ml, 200μl, 20μl,10μl, 2μl) | Eppendorf | ||
| Tubes (Amber) | Fisher | 50819772 | |
| Centrifuge | Sorvall Legend RT+ | 75004377 | |
| Hemacytometer | Fisher Scientific | 267110 | |
| Upright Microscope | Zeiss | Axioskop40 | |
| NOD.Cg-Rag1tm1Mom Tg(TcraAI4)1Dvs/DvsJ Mice | The Jackson Laboratory | 004347 | |
| NOD.Cg-Rag1tm1Mom Tg(TcrbAI4)1Dvs/DvsJ Mice | The Jackson Laboratory | 004348 | |
| NOD-AI4α/ β F1 mice | N/A | N/A | Bred in UF animal facility |
References
- Hamaguchi, K., Gaskins, H. R., Leiter, E. H. NIT-1, a pancreatic beta-cell line established from a transgenic NOD/Lt mouse. Diabetes. 40, 842-849 (1991).
- Chen, J., Gusdon, A. M., Piganelli, J., Leiter, E. H., Mathews, C. E. mt-Nd2a modifies resistance against autoimmune Type 1 diabetes in NOD mice at the level of the pancreatic beta cell. Diabetes. , (2010).
- Scaduto, R. C., Grotyohann, L. W. Measurement of mitochondrial membrane potential using fluorescent rhodamine derivatives. Biophys J. 76, 469-477 (1999).
- Lemasters, J. J., Ramshesh, V. K. Imaging of mitochondrial polarization and depolarization with cationic fluorophores. Methods Cell Biol. 80, 283-295 (2007).
- Abel, M., Krokowski, M. Pathophysiology of immune-mediated (type 1) diabetes mellitus: potential for immunotherapy. BioDrugs. 15, 291-301 (2001).
- Mathews, C. E., Graser, R. T., Savinov, A., Serreze, D. V., Leiter, E. H. Unusual resistance of ALR/Lt mouse beta cells to autoimmune destruction: role for beta cell-expressed resistance determinants. Proc Natl Acad Sci U S A. , 235-240 (2001).
- Szabadkai, G., Duchen, M. R. Mitochondria mediated cell death in diabetes. Apoptosis. 14, 1405-1423 (2009).
- Ly, J. D., Grubb, D. R., Lawen, A. The mitochondrial membrane potential (deltapsi(m)) in apoptosis; an update. Apoptosis. 8, 115-128 (2003).
- Dudek, N. L. Cytotoxic T-cells from T-cell receptor transgenic NOD8.3 mice destroy beta-cells via the perforin and Fas pathways. Diabetes. 55, 2412-2418 (2006).
- Pakala, S. V., Chivetta, M., Kelly, C. B., Katz, J. D. In autoimmune diabetes the transition from benign to pernicious insulitis requires an islet cell response to tumor necrosis factor alpha. J Exp Med. 189, 1053-1062 (1999).
