Metodi per valutare la morte delle cellule beta Mediata da linfociti T citotossici
Summary
Cellulo-mediata linfocitotossicità (LMC) test può essere usato per testare le risposte autoreattivi e lo studio dei meccanismi di morte cellulare in vitro. Tuttavia, utilizzando tecniche confocale live-cell immagini microscopiche con coloranti fluorescenti, il tipo e la cinetica di morte cellulare così come i percorsi utilizzati possono essere studiati in maggiore dettaglio.
Abstract
Diabete di tipo 1 (T1D) è una malattia mediata da cellule T autoimmuni. Durante la patogenesi, i pazienti diventano progressivamente più insulinopenic come la produzione di insulina è perso, probabilmente questa è dovuta alla distruzione delle cellule beta pancreatiche da parte delle cellule T. La comprensione dei meccanismi di morte delle cellule beta durante lo sviluppo del diabete di tipo 1 fornirà spunti per generare una cura efficace per questa malattia. Cellulo-mediata linfocitotossicità (LMC), saggi, storicamente, hanno utilizzato il radionuclide cromo 51 (51 Cr) per etichettare le cellule bersaglio. Questi obiettivi sono quindi esposti alle cellule effettrici e il rilascio di 51 Cr da cellule bersaglio viene letto come un'indicazione di mediata dai linfociti morte cellulare. Inibitori di conseguenza la morte cellulare in versione ridotta di 51 Cr.
Come cellule effettrici, abbiamo utilizzato un autoreattivi attivati popolazione clonale di CD8 + linfociti T citotossici (CTL) isolato da un topo transgenico magazzino sia per l'alfa e catene beta del recettore AI4 delle cellule T (TCR). AI4 cellule T attivate sono state co-coltura con 51 cellule bersaglio Cr etichettati NIT per 16 ore, il rilascio di 51 Cr è stato registrato per calcolare lisi specifiche
Mitocondri partecipare a molti eventi fisiologici importanti, come la produzione di energia, regolazione della trasduzione del segnale, e l'apoptosi. Lo studio delle cellule beta cambia mitocondriale funzionale durante lo sviluppo di diabete di tipo 1 è una zona nuova della ricerca. Utilizzando il potenziale di membrana mitocondriale colorante tetrametile rodamina estere metilico (TMRM) e confocale di immagini microscopiche cellule vive, abbiamo monitorato il potenziale della membrana mitocondriale nel corso del tempo nella linea di cellule beta NIT-1. Per gli studi di imaging, le cellule T effettrici AI4 sono stati etichettati con il colorante fluorescente nucleare colorazione PicoGreen. NIT-1 le cellule e le cellule T sono state co-coltura in chambered coprioggetti e montato sul palco microscopio dotato di una camera di cellule vive, controllata a 37 ° C, con il 5% di CO 2, e umidificata. Durante questi esperimenti immagini sono state prese di ogni cluster ogni 3 minuti per 400 minuti.
Più di un corso di 400 minuti, abbiamo osservato la dissipazione del potenziale di membrana mitocondriale in NIT-1 gruppi di cellule in cui sono state allegate AI4 cellule T. Nell'esperimento controllo simultaneo in cui NIT-1 cellule sono state co-coltura con MHC mis-matched cellule umane Jurkat linfociti, potenziale di membrana mitocondriale è rimasto intatto. Questa tecnica può essere usata per osservare in tempo reale i cambiamenti del potenziale di membrana mitocondriale nelle cellule sotto l'attacco dei linfociti citotossici, citochine o altri reagenti citotossici.
Protocol
Discussion
Cellule T citotossiche mediate la morte delle cellule beta è la fisiopatologia principale di diabete di tipo 1 5. Saggi di CML con 51 rilascio Cr ci permettono di studiare il grado di effettrici bersaglio risposta 6. Tuttavia, il processo dettagliate e percorsi di T mediata dalle cellule morte delle cellule beta non è ancora pienamente compreso. Dal momento che i mitocondri sono fondamentali per la funzione delle cellule beta e la morte 7, ci siamo concentrati sui cambiament…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto dalle concessioni dal National Institutes of Health DK074656 e AI56374 (CEM), così come la Juvenile Diabetes Research Foundation.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| Cr-51 | Perkin Elmer | NEZ030500IMC | |
| PBS | Cellgro | 21-040-60 | |
| Tetramethyl Rhodamine Methyl Ester (TMRM) | Invitrogen | T668 | |
| Picogreen | Invitrogen | P7581 | |
| AI4 mimotope | mimotopes.com | amino acid sequence: YFIENYLEL | |
| IL-2 | R & D | 485-MI | |
| DMEM | Invitrogen | 11885 | |
| FBS | HyClone | SH30071.03 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A8412 | |
| HEPES | Cellgro | 25-060-Cl | |
| MEM Non-Essential Amino Acids | GIBCO | 11140 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gemini | 400-109 | |
| Phenol red-free DMEM | Sigma | D5303 | |
| CO2 Incubator | Thermo Fisher | HeraCell 150i | Kept sterile for cell culture |
| Biological safety cabinet | Thermo Fisher | Forma 1440 | |
| Disposable culture tubes, 6×50 mm Lime Glass | Fisher | 14-958-A | |
| Gamma Counter | Perkin Elmer | Wizard 1470 Automatic Gamma Counter | |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM 510 Meta Confocal | With motorized stage and live cell chamber |
| Pipette (1ml, 200μl, 20μl,10μl, 2μl) | Eppendorf | ||
| Tubes (Amber) | Fisher | 50819772 | |
| Centrifuge | Sorvall Legend RT+ | 75004377 | |
| Hemacytometer | Fisher Scientific | 267110 | |
| Upright Microscope | Zeiss | Axioskop40 | |
| NOD.Cg-Rag1tm1Mom Tg(TcraAI4)1Dvs/DvsJ Mice | The Jackson Laboratory | 004347 | |
| NOD.Cg-Rag1tm1Mom Tg(TcrbAI4)1Dvs/DvsJ Mice | The Jackson Laboratory | 004348 | |
| NOD-AI4α/ β F1 mice | N/A | N/A | Bred in UF animal facility |
References
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