Live-cell imaging av sensoriska celler orgel Precursor i intakt Drosophila Puppor

<p class="jove_content"<strong> Material som behövs:</strong> Dissection stereomikroskop, dubbelsidig tejp, standard objektglas och täckglas, dissektion pincett (storlek 5 eller 5,5), mjuk borste, silikon vakuum fett, 5cc spruta, Whatman papper, konfokala eller epifluorescensmikroskop med digitalkamera och bild Förvärvet programvara.</p><p class="jove_title"> 1. PUPP-Dissection</p><ol><li> Sätt upp ett kors (med lämplig kombination av Gal4 linje och en GFP taggad fusionsprotein i UAS kontroll) eller flyger plats från ett lager du önskar bild i flera färska flaskor vid 25 ° C.</li><li> SOP celler i allmänhet börjar att föröka sig på PUPP-bröstkorgen på arton timmar efter debut av pupariation väljer vi därför "vita" puppor från lämplig fluga lager eller kors. Vit puppor har PUPP-morfologi, men har en opigmenterad PUPP-fallet, vilket tyder på att det har pupariated inom en timme.</li><li> Vänta cirka 18 timmar.</li><li> Lägg en bit dubbelhäftande tejp på bilden. Samla puppor och följa de PUPP-ärendet till dubbelhäftande tejp med den ventrala sidan nedåt. Ta tag i kanten på gällocket (den runda luckan på den främre ryggfenan spets PUPP-fallet) med pincett</li><li> Lyft försiktigt, ta bort och kassera gällocket, avslöjar chefen för omogna flugan.</li><li> Använd pincett för att börja riva längs sidan av PUPP-fallet. Lyft midsection av PUPP-fallet från sönderrivna sidan och ta med den över till motsatt sida, antingen ta bort den helt eller koppla den till bandet, avslöjar bröstkorgen och främre delen av buken. (<strong> Not</strong>: Det finns ett gap mellan u-flugan och PUPP-fallet. Var noga med att inte punktera flyga så väggen i fallet är trasiga.)</li><li> Börjar såga längs samma sida av PUPP-fallet mot den bakre änden. Återigen, vara noga med att inte punktera den flyga. Dra PUPP-målet till motsatt sida av flugan och trycker den på dubbelhäftande tejp. Buken bör nu vara fullt exponerade. Placera mjuk borste direkt under chefen för flugan. När flugan sitter fast i borsten och fri från PUPP-fallet, använd borste för att försiktigt lyfta flyga från glaset.</li></ol><p class="jove_title"> 2. PUPP-Montering</p><p class="jove_content"> Efter dissektion är puppor sedan monteras mellan bild och täckglas:</p><ol start="8"><li> Isolerat puppor bort från fallet kan sedan placeras på mitten av en glasskiva ryggsidan uppåt.</li><li> Gör en fyrkantig ram av Whatman papper 18X18mm lämnar en 10×10 mm öppning i mitten. Doppa papperet i vatten tills mättad. Placera runt puppor.</li><li> Med hjälp av en 5 cc spruta fylld med silikon vakuum fett, tillämpa en enhetlig lager fett runt Whatman ramen. Fettet lagret ska rymmas inom täckglas (figur 1) och tjockleken bör endast lite större än PUPP-diameter.</li><li> Placera en liten droppe vatten (1 l) i mitten av en 22×22 mm täckglas och placera täckglas på ovanstående förberedelser så att den lilla vattendroppe i kontakt med ytan som du vill bilden, notum i detta fall). Komprimera försiktigt för att bilda en komplett tätning av vakuum fett och platt kontaktyta mellan täckglas och PUPP-nagelband.</li><li> Prep kan sedan avbildas på omvänd eller upprätt microcopes, antingen epifluorecence, konfokala (laserskanning eller spinning disk typ) eller två-photon konfokala. Om du är försiktig, kan vuxna flugor återvinnas efter flera dagar.</li></ol><p class="jove_title"> 3. Representativa resultat:</p><p class="jove_content"> Använda en SOP-specifik Gal4 linje (<em> Neuralized</em>-Gal4) skar till GFP taggade proteiner för att märka mitotiska spindeln (tubulin eller Tau-GFP) eller histonproteiner (H2B-GFP), kan man observera division plan SOP celldelning, längd av cellcykeln, eller antal mitotisk divisioner med tid förfaller imaging⁹. Andra fusionsproteiner som riktar cellulära organeller såsom Rab-GTPases att markera olika endocytic fack (Rab5-GFP för tidig endosomes eller Rab11 GFP för återvinning endosomes) eller proteiner viktiga i Notch-signalering förordning (Numb-, partner Numb-GFP, eller Sanpodo -GFP) kan ge viktiga insikter i de mekanismer som asymmetrisk celldelning och membranprotein människohandel^2,3,7,10,11.</p><p class="jove_content"<img src="/files/ftp_upload/2706/2706fig1.jpg" alt="Figure 1" /<br /><strong> Figur 1: PUPP-dissektion och montering. A.</strong> Steg för steg-bilder visar proceduren för att ta bort PUPP-fallet och förbereda intakt puppor för montering och levande cell imaging. Puppor tas bort från flaskan och placerade, bröst uppåt på dubbel tejp ansluten till en glasskiva. Första kolumnen, borttagning av gällock och riva längs sidan av PUPP-fallet. Andra kolumnen, borttagning av PUPP-fallet från bröstkorg och buk-regionen. Den fria puppa är då lyfts från PUPP-fallet med en mjuk borste.<strong> B.</strong> Montering puppor mellan bild och täckglas. Puppa placeras dorsal-sida upp på glasplatta, omgiven av en fuktad ram av Whatman papper. En kontinuerlig sträng med silikon vakuum fett extruderade från en 5cc spruta funktioner för att försegla bild-täckglas kombination, skydda puppan från såväl uttorkning och upphöja täckglas så att den vilar lätt på PUPP-thorax. En liten droppe vatten (1 l) i gränssnittet mellan täckglas och thorax nagelband förbättrar bildkvaliteten avsevärt vid användning av nedsänkning mål (vatten eller olja).<a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/2706/2706fig1_large.jpg"> Klicka här för att visa en större bild</a>.</p><p class="jove_content"<img src="/files/ftp_upload/2706/2706fig2.jpg" alt="Figure 2" /<br /><strong> Figur 2: Representant bilder av levande SOP celler och differentierade yttre sinnesorgan tagit hjälp av vår PUPP-dissektion och montering förfarande. En</strong>. Bilder ur en tidsserie av en mitotiska SOP cell som manifesterar aktin-GFP fusionsprotein under kontroll av<em> Neuralized-</em> Gal4 (<em> Neur-</em> Gal4/UAS-actin-GFP), not kortikala ansamling av aktin vid klyvningen fåran (1 bild / varje 2 minuter).<strong> B</strong>. SOP dotter celler samtidigt uttrycker partner Numb-RFP (röd) och Rab5-GFP drivs av<em> Neuralized-</em> Gal4 Notera den asymmetriska fördelningen av Pon-RFP i en dottercell (pIIb) och distribution av tidig endosomes i både dottern celler.<strong> C</strong>. Volym rendering av ett z-serien tas differentierade yttre sinnesorgan i ett sent puppstadium. Cuticle strukturer, t.ex. mechnosensory borst och epidermal hår avslöjades av nagelband autofluorescens (röd). Dessutom har vi använt MARCM systemet att uttrycka LGL-GFP (drivs av<em> Neuralized-</em> Gal4) i en delmängd av sensoriska celler orgel föregångare (grön). (Dessa bilder var alla förvärvats med hjälp av en Nikon C1 scanning konfokalmikroskop med en 60X 1,45 NA mål)</p>