Live-cell imaging van zintuig voorloper cellen in Intact Drosophila Poppen

<p class="jove_content"<strong> Vereiste Materialen:</strong> Dissection stereo-microscoop, dubbelzijdig tape, standaard microscoopglaasje en dekglaasje, dissectie pincet (maat 5 of 5.5), zachte borstel, siliconen vacuüm vet, 5cc spuit, Whatman papier, confocale of epifluorescentiemicroscoop met digitale camera en beeld acquisitie software.</p><p class="jove_title"> 1. Popstadium Dissection</p><ol><li> Stel een kruis (met de juiste combinatie van Gal4 lijn en een GFP gelabelde fusie-eiwit onder UAS controle) of plaats vliegt uit een voorraad die u wenst om de afbeelding in verschillende verse flesjes bij 25 ° C.</li><li> SOP-cellen over het algemeen beginnen te verspreiden op het popstadium thorax op achttien uur na het begin van de verpopping, we daarom selecteert u "wit" poppen uit de betreffende vliegen voorraad of over te steken. Witte poppen hebben het popstadium morfologie, maar hebben een ongepigmenteerde pupal geval is, wat aangeeft dat die pupariated binnen het uur.</li><li> Wacht ongeveer 18 uur.</li><li> Leg een stuk dubbelzijdig plakband op de dia. Verzamel poppen en houden het popstadium zaak naar de dubbelzijdige tape met de buikzijde naar beneden. Pak de rand van het operculum (het ronde luik op de voorste dorsale punt van het popstadium geval) met de tang</li><li> Til, te verwijderen, en gooi het operculum, onthullen het hoofd van de onvolwassen vliegen.</li><li> Gebruik de tang om te beginnen met scheuren langs de zijkant van het popstadium geval. Til de buik van het popstadium zaak uit de gescheurde kant en breng deze over naar de andere kant, ofwel volledig te verwijderen of bevestig het aan de tape, het openbaren van de thorax en de voorste deel van de buik. (<strong> Opmerking</strong>: Er is een kloof tussen de ontwikkeling van vliegen en het popstadium geval. Wees niet te doorboren de vliegen als de wand van de behuizing is gescheurd.)</li><li> Begin snijden langs dezelfde kant van het popstadium geval naar de achterkant einde. Nogmaals, wees niet te doorboren de vlieg. Trek aan de pop-zaak naar de andere kant van de vlieg en druk op de dubbelzijdige tape. De buik moet nu volledig worden vrijgemaakt. Plaats de zachte borstel direct onder het hoofd van de vlieg. Zodra de vlieg vast aan de borstel en vrij van het popstadium geval gebruikt u de borstel om til-the-fly het glaasje af.</li></ol><p class="jove_title"> 2. Popstadium Montage</p><p class="jove_content"> Na dissectie, zijn poppen vervolgens gemonteerd tussen schuiven en dekglaasje:</p><ol start="8"><li> Geïsoleerde poppen verwijderd zaak kan dan worden geplaatst op het midden van een glasplaatje dorsale kant naar boven.</li><li> Maak een vierkant frame van Whatman papier 18X18mm het verlaten van een 10×10 mm opening in het midden. Dompel het papier in water tot verzadiging. Plaats rond de poppen.</li><li> Met behulp van een 5 cc injectiespuit gevuld met siliconen vacuüm vet, breng dan een uniforme laag van vet rond de Whatman frame. Het vet laag moet passen binnen het dekglaasje (figuur 1) en de dikte moet alleen een beetje groter dan de popstadium diameter.</li><li> Een kleine druppel water (1 pl) Plaats in het midden van een 22×22 mm dekglaasje en het dekglaasje op de bovenstaande bereiding plaats van dien aard dat de kleine waterdruppel contact komt met het oppervlak dat u wilt dat het beeld, notum in dit geval). Comprimeer voorzichtig om een ​​volledige afsluiting van vacuüm vet en vlakke contact oppervlak tussen de dekglaasje en popstadium cuticula te vormen.</li><li> Voorbereiding kan vervolgens worden afgebeeld op de omgekeerde of rechtop microcopes, met behulp van epifluorecence, confocale (laser scanning of een draaiende schijf type) of twee-foton confocale. Als je voorzichtig bent, kunnen volwassen vliegen worden hersteld na enkele dagen.</li></ol><p class="jove_title"> 3. Representatieve resultaten:</p><p class="jove_content"> Met behulp van een SOP-specifieke Gal4 lijn (<em> Neuralized</em>-Gal4) gekruist met GFP gelabelde eiwitten om de mitotische spindel (tubuline of Tau-GFP) of histon-eiwitten (H2B-GFP) label, kan men observeren divisie vlak van SOP celdeling, de lengte van de celcyclus, of het aantal mitotische divisies door gebruik te maken time lapse imaging⁹. Andere fusie-eiwitten die de cellulaire organellen zoals Rab-GTPases te richten op de verschillende compartimenten endocytische mark (Rab5-GFP voor vroege endosomen of Rab11 GFP voor recycling endosomen) of eiwitten belangrijk in Notch signalisatie regelgeving (Numb-, Partner van Numb-GFP, of Sanpodo -GFP) kan opleveren belangrijke inzichten in de mechanismen van asymmetrische celdeling en membraaneiwit mensenhandel^2,3,7,10,11.</p><p class="jove_content"<img src="/files/ftp_upload/2706/2706fig1.jpg" alt="Figure 1" /<br /><strong> Figuur 1: popstadium dissectie en montage. A.</strong> Stap-voor-stap beelden tonen de procedure om het popstadium geval te verwijderen en intact poppen voor te bereiden op de montage en live cell imaging. Poppen worden verwijderd uit de flacon en geplaatst, dorsale kant naar boven, op dubbele plakband bevestigd aan een glasplaatje. Eerste kolom, het verwijderen van de operculum en scheuren langs de zijkant van het popstadium geval. Tweede kolom, het verwijderen van pupal zaak uit thoracale en abdominale regio. De gratis pop wordt dan opgetild uit het popstadium geval met een zachte borstel.<strong> B.</strong> Montage poppen tussen de glijbaan en dekglaasje aan. Pupa is geplaatst rug-kant naar boven op het glasplaatje, omgeven door een vochtig frame van Whatman papier. Een continue kraal van siliconen vacuüm vet geëxtrudeerd uit een 5cc spuit functies toe aan de dia-dekglaasje combinatie van afdichting, de bescherming van de pop van uitdroging en verheffen het dekglaasje, zodat het rust zachtjes op de popstadium thorax. Een kleine druppel water (1 pi) op ​​het grensvlak tussen het dekglaasje en de thorax cuticula verbetert de beeldkwaliteit aanzienlijk bij het gebruik van immersie doelstellingen (water of olie).<a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/2706/2706fig1_large.jpg"> Klik hier om een ​​grotere afbeelding te bekijken</a>.</p><p class="jove_content"<img src="/files/ftp_upload/2706/2706fig2.jpg" alt="Figure 2" /<br /><strong> Figuur 2: Representatieve beelden van levende cellen en SOP gedifferentieerde externe zintuigen gemaakt met behulp van onze popstadium dissectie en montage procedure. Een</strong>. Beelden uit een tijdreeks van een mitotische SOP cel die actine-GFP fusie-eiwit onder controle van<em> Neuralized-</em> Gal4 (<em> Neur-</em> Gal4/UAS-actin-GFP), let corticale accumulatie van actine aan de splitsing groef (1 image / elke 2 minuten).<strong> B</strong>. SOP dochtercellen co-expressie Partner van Numb-RFP (rood) en Rab5-GFP gedreven door<em> Neuralized-</em> Gal4, let op de asymmetrische verdeling van de Pon-RFP in een dochter cel (pIIb) en de verdeling van de vroege endosomen in beide dochtercellen.<strong> C</strong>. Volume rendering van een z-serie gemaakt van een gedifferentieerde externe zintuigen in een laat popstadium. Cuticle structuren, zoals mechnosensory borstels en de epidermale haren onthuld door nagelriem autofluorescentie (rood). Daarnaast hebben we het gebruikte MARCM systeem om Lgl-GFP (aangedreven door uitdrukkelijke<em> Neuralized-</em> Gal4) in een subset van zintuig voorloper cellen (groen). (Deze beelden werden alle verworven met een Nikon C1 scanning confocale microscoop met behulp van een 60X 1,45 NA doel)</p>