تعيش خلية التصوير الحسي للخلايا السليمة في الجهاز السلائف ذبابة الفاكهة شرانق

<p class="jove_content"<strong> المواد المطلوبة :</strong> تشريح ستيريو المجهر ، الشريط على الوجهين ، شريحة المجهر القياسية وساترة ، ملقط تشريح (حجم 5 أو 5.5) ، لينة ذات شعيرات الفرشاة ، سيليكون الشحوم فراغ ، حقنة 5cc ، ورقة Whatman ، أو مبائر epifluorescence المجهر مع الكاميرا الرقمية والصور اقتناء البرمجيات.</p><p class="jove_title"> 1. تشريح العذراء</p><ol><li> إعداد الصليب (باستخدام توليفة مناسبة من خط Gal4 والبروتين GFP الانصهار الموسومة تحت السيطرة UAS) أو الذباب مكان من الأسهم التي ترغب في الصورة في قوارير جديدة عدة عند 25 درجة مئوية.</li><li> خلايا SOP عموما يبدأ تتكاثر على الصدر العذراء في ثمانية عشر ساعة بعد ظهور pupariation ، ولذلك قمنا باختيار "البيض" عذارى من المخزون المناسب أو عبر ذبابة. الشرانق بيضاء لها التشكل العذراء ، ولكن قضية شعر عديم الصبغة العذراء ، مشيرا إلى أنها قد pupariated في غضون ساعة.</li><li> انتظر حوالي 18 ساعة.</li><li> ضع قطعة من الشريط على الوجهين على الشريحة. جمع الشرانق والتمسك حالة العذراء إلى الشريط على الوجهين مع الجانب البطني أسفل. فهم على حافة الوصاد (الفتحة الدائرية على الحافة الأمامية الظهرية للقضية العذراء) مع ملقط</li><li> برفق رفع وإزالة وتجاهل الوصاد ، وكشف رئيس الطيران غير ناضجة.</li><li> استخدم ملقط لبدء تمزق على طول الجانب من القضية العذراء. رفع القسم الوسطي للقضية العذراء من الجانب ممزقة وجعله أكثر إلى الجانب الآخر ، إما إزالة تماما أو نعلق على الشريط ، وكشف عن الصدر والجزء الأمامي من البطن. (<strong> ملاحظة</strong> : هناك فجوة بين البلدان النامية ويطير حالة العذراء. يجب الحرص على عدم ثقب يحدث تمزق في جدار ويطير في القضية.)</li><li> قطع بيغن على طول نفس الجانب من القضية العذراء قرب نهاية الخلفي. مرة أخرى ، يجب الحرص على عدم ثقب الطيران. سحب القضية العذراء إلى الجانب الآخر من الطيران واضغط عليه على الشريط على الوجهين. وينبغي الآن أن يتعرض البطن بالكامل. مكان الفرشاة ذات شعيرات ناعمة مباشرة تحت رئيس الطيران. بمجرد عالق يطير إلى الفرشاة وخالية من حالة العذراء ، واستخدام الفرشاة بلطف لرفع حظر الطيران خارج الشريحة.</li></ol><p class="jove_title"> 2. تركيب العذراء</p><p class="jove_content"> وبعد التشريح ، هي التي شنت ثم الشرانق بين الشرائح وساترة :</p><ol start="8"><liويمكن بعد ذلك> الشرانق المعزولة إزالتها من الأحوال أن توضع على مركز للزجاج الجانب الظهري الشريحة الأعلى.</li><li> جعل الإطار مربع من الورق Whatman 18X18mm ترك 10X10 مم فتحة في الوسط. ورقة في الماء حتى تزج المشبعة. حول مكان الشرانق.</li><li> استخدام حقنة مليئة 5 سم فراغ سيليكون الشحوم ، وتطبيق طبقة موحدة من الشحوم حول الإطار Whatman. ينبغي للطبقة الشحوم تدخل ضمن ساترة (الشكل 1) وسمك يجب أن يكون فقط قليلا أكبر من القطر العذراء.</li><li> ضع قطرة ماء صغيرة (1 ميكرولتر) في وسط ساترة 22X22 مم ووضع ساترة على إعداد مثل أعلاه أن قطرة الماء الصغيرة اتصالات سطح تريد notum ، الصورة في هذه الحالة). ضغط برفق على شكل خاتم كاملة من الشحوم فراغ والمسطحة سطح التماس بين ساترة وبشرة العذراء.</li><li> هل يمكن تصوير ثم الإعدادية في microcopes المقلوب أو تستقيم ، وذلك باستخدام إما epifluorecence ، مبائر (ليزر المسح أو الغزل نوع القرص) أو ثنائي الفوتون مبائر. إذا كنت حذرا ، يمكن استرداد الذباب الكبار بعد عدة أيام.</li></ol><p class="jove_title"> 3. ممثل النتائج :</p><p class="jove_content"> استخدام خط Gal4 SOP محددة (<em> neuralized</em> – Gal4) عبروا إلى البروتينات GFP المفتاحية لتسمية المغزل الإنقسامية (تويولين أو تاو GFP) أو البروتينات هيستون (H2B – GFP) ، يمكن للمرء أن يلاحظ الطائرة تقسيم SOP انقسام الخلايا ، وطول دورة الخلية ، أو عدد الإنقسامية الانقسامات باستخدام الفاصل الزمني التصوير⁹. بروتينات الاندماج الأخرى التي تستهدف العضيات الخلوية مثل الرب ، GTPases بمناسبة مقصورات التقامي مختلفة (Rab5 – GFP في أوائل الإندوسومات أو الإندوسومات Rab11 GFP لإعادة التدوير) أو البروتينات المهمة في التنظيم يدل نوتش (خدران ، الشريك في GFP – خدران أو Sanpodo يمكن – GFP) العائد معلومات هامة في آليات انقسام الخلايا والأغشية الاتجار غير المتماثلة البروتين^{2،3،7،10،11}.</p><p class="jove_content"<img src="/files/ftp_upload/2706/2706fig1.jpg" alt="Figure 1" /<br /><strong> الشكل 1 : تشريح العذراء والتركيب. أ.</strong> الخطوة بخطوة تظهر الصور الإجراء لإزالة حالة العذراء وإعداد الشرانق سليمة لتصوير الخلايا الحية والتركيب. شرانق يتم إزالتها من قارورة وضعت ، حتى الجانب الظهري ، على الشريط المزدوج عصا موصولة إلى شريحة زجاجية. العمود الأول ، وإزالة وتمزيق الوصاد على طول الجانب من القضية العذراء. العمود الثاني ، وإزالة حالة العذراء من منطقة الصدر والبطن. ثم يتم رفع خادرة خالية من حالة العذراء به شعيرات فرشاة ناعمة.<strong> B.</strong> تركيب الشرانق بين الشرائح وساترة. يوضع خادرة الجانب الظهري حتى على شريحة زجاجية ، محاط بإطار من الورق المبلل Whatman. حبة المستمر للسيليكون الشحوم فراغ مقذوف من الوظائف حقنة 5cc لختم تركيبة الانزلاق ساترة ، وحماية خادرة من أصاب ورفع ساترة لذلك تقع على الصدر بلطف العذراء. قطرة ماء صغيرة (1 ميكرولتر) في واجهة بين ساترة وبشرة الصدر يحسن من جودة الصورة بشكل ملحوظ عند استخدام الأهداف الغمر (الماء أو الزيت).<a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/2706/2706fig1_large.jpg"> اضغط هنا لعرض صورة أكبر حجما</a>.</p><p class="jove_content"<img src="/files/ftp_upload/2706/2706fig2.jpg" alt="Figure 2" /<br /><strong> الشكل 2 : صور الممثل من الخلايا الحية ومتباينة SOP الحواس الخارجية التي يتم التقاطها باستخدام تشريح لدينا العذراء وتصاعد الداخلي. A</strong>. الصور المستخرجة من سلسلة زمنية من الإنقسامية معربا عن الخلية SOP – أكتين البروتين GFP الانصهار تحت سيطرة<em> neuralized -</em> Gal4 (<em> neur -</em> Gal4/UAS-actin-GFP) ، لاحظ تراكم القشرية من أكتين في ثلم الانقسام (1 صورة / كل دقيقة 2).<strong> B</strong>. الخلايا الوليدة SOP المشترك معربا عن شريك RFP – خدران (الحمراء) ، وRab5 – GFP مدفوعا<em> neuralized -</em> Gal4 ، لاحظ التوزيع غير المتساوي لبون ، RFP في خلية ابنة واحدة (pIIb) وتوزيعها في وقت مبكر من الإندوسومات في كل من الخلايا الوليدة.<strong> C</strong>. مما يجعل من حجم Z – اتخذت سلسلة من الأجهزة المختلفة الحسية الخارجية في مرحلة العذراء في وقت متأخر. هياكل بشرة ، مثل mechnosensory شعيرات وكشف الشعر البشرة بواسطة تألق ذاتي إهاب (الحمراء). بالإضافة إلى ذلك ، لقد استخدمنا نظام MARCM للتعبير عن LGL – GFP (مدفوعة<em> neuralized -</em> Gal4) في مجموعة فرعية من الخلايا الحسية السلائف الجهاز (الخضراء). (تم الحصول عليها عن هذه الصور باستخدام مجهر المسح C1 نيكون مبائر باستخدام 60X الهدف NA 1.45)</p>