Eletrofisiologia da Scorpion Peg sensilla

1. Pré-gravação, Preparação Animais Vivos Remova o escorpião do seu jar casa e colocá-lo em um recipiente de vidro pré-refrigerados; seguinte, coloque o jar contendo o escorpião em um ambiente de congelamento (-5 ° C) por um período mínimo de dois minutos. Este tempo pode variar de acordo com a idade, tamanho, espécies, etc do escorpião específica em estudo. Mas, geralmente, a fase de ambiente de congelamento é completo quando o animal está imóvel. Depois de dois minutos, retire o escorpião imobilizado do recipiente de vidro frio, e colocá-lo lado ventral para cima sobre uma lâmina de microscópio. Segura o ferrão, cauda, ​​pernas e pedipalpos com barro moldável (à base de óleo, Van Aken Plastalina). Tornar uma plataforma na qual a colocar pectinas do escorpião. Ajustar o comprimento da plataforma e largura de acordo com o tamanho do pecten. Tipicamente, as nossas plataformas são construídos a partir de tampa de vidro do microscópio e são aproximadamente 10 (L) X 18 mm (W). Aderem fita dupla face adesiva para a plataforma pecten, aparando a fita (se necessário) para se adequar. Para fazer com que uma câmara pectínios, coloque três dos quatro lados da plataforma, em pré-fundido de cera (que usam chips de cera de abelha 100%) a uma profundidade de 3-4 mm. Nós derreter a cera, colocando as fichas em uma placa de Petri de vidro, localizada em uma chapa quente. Uma vez que a cera nas bordas da câmara de pectínios é resfriado a temperatura ambiente, este deve criar paredes de cera cerca de 1 mm de altura. Sobre o animal, localizar o ponto de inserção pectínios, e coloque a borda un-encerado da plataforma (fita up-side) imediatamente posterior a ele. Depois, estabilizar a plataforma (para que ele não se moverá mais tarde) pressionando suavemente a sua direita e esquerda bordas periféricas contra o barro utilizado para limitar as pernas do animal. Use uma pinça de ponta fina, coloque cuidadosamente a pecten pectinas ou no interior da câmara. Especificamente, usando uma pinça, segure o pecten ao longo da espinha pectínios, e gentilmente trazer o pecten de baixo da tampa de vidro e abaixá-lo para o chão plataforma adesivo. Estabelecer um vínculo pecten-para-fita com cuidado de aplicar pressão sobre a coluna pectínios. Agora, aplique cera derretida (nós usamos uma espátula de metal pré-aquecido) até a borda un-encerado da plataforma. O objetivo é duplo, para garantir a pecten e para envolver completamente a câmara para futura introdução de óleo mineral. Tenha cuidado ao aplicar a cera sobre pecten do animal, como é possível danificar o pecten com cera que é muito quente. A construção da câmara pecten está completa. Em seguida, estabeleça uma conexão eletrodo indiferente com hemolinfa do animal através da inserção de um fio de prata entre dois segmentos da cauda. 2. Gravação simultânea Extracelular e Estimulação Química Nós preparamos o animal 24 horas antes da realização extracelular, tip-gravações, que, entre outras razões (ou seja, ajuste de posição fixa para animais), dá tempo para fazer custom-pipetas de um estimulante específico (sensillum-dependente) da ponta de diâmetro. Usamos um extrator micropipeta para se alcançar tais especificações. Idealmente, o diâmetro das pipetas é ≈ 2 M maior do que o diâmetro dos poros sensillar. Nós ajustamos nossas especificações micropipeta de acordo para cada animal. 1 h antes da gravação, adicionar 5 mL de óleo mineral para a câmara de pectínios, submergindo o pecten sob óleo. Então, a posição do animal debaixo de um microscópio de alta potência, que há muito trabalho a distância e objetivos epi-iluminação. Para estimular quimicamente peg sensilla, introduzimos tastants aquoso (ou seja, ácido cítrico e sal) por meio de óleo. Primeiro, usamos um enchimento micropipeta para injetar o estimulante para a pipeta estimulante. Nota: todas as soluções estimulante deve conter um eletrólito de condutância elétrica. Em seguida, após o posicionamento da pipeta estimulante em um micromanipulador (no equipamento de gravação), insira o eletrodo de registro para o fim, sem corte aberto da pipeta estimulante. É importante para garantir o contato entre o eletrodo de metal e uma solução eletrolítica estimulante. Uma vez que a preparação é eletricamente aterrado (através do eletrodo indiferente), simplesmente diminuir a pipeta através do meio de petróleo e em um poro sensillar. A duração da estimulação química por sensillum pectínios pode variar de tanto quanto 30 minutos para apenas um segundo. Geralmente, podemos amostra pinos múltiplos (> 30) por pipeta. No caso em que a pipeta estimulantes torna-se obstruídas por escombros minuto, simplesmente trocar a pipeta entupidos de uma pipeta, nova sem uso. 3. Preparação de um animal por vários dias de Experimentação Se o animal deve ser usado durante um período de tempo prolongado, recomendamos a reutilização da câmara pectínios e substituindo a gota de óleo mineral para cada sessão de gravação. Após a sessão de um determinado dia de gravação estiver concluída, remova o animal a partir da gravação de set-up e fazer uma lavagem de óleo mineral. Specifically, adicionar uma gota (5 L) de óleo mineral para a câmara, e remover todo o óleo. Isso ajuda a minimizar a presença de estimulantes residual, o que pode ter vazado para fora da pipeta durante a sessão de gravação. Antes da próxima sessão, adicione uma gota de óleo como descrito anteriormente. 4. Resultados representativos: Dependendo do equipamento de gravação utilizado (por exemplo, o amplificador particular, digitalização hardware, etc), um resultado representativo é uma gravação extracelular com um S: N proporção de pelo menos 3:1. Sucesso na construção da câmara de óleo mineral é necessário para isolar a estimulação química sensilla individual, uma vez que fornece um meio para a entrega tastants química polar (à base de água) 8. Se houver óleo muito pouco ou mesmo nenhum, a solução vai se espalhar estimulante do sensillum gravadas ao seu sensilla vizinhos, o que é susceptível de causar um ataque prolongado e descontrolado de químicos estimulação 8.