Electrophysiology של העקרב פג Sensilla

1. טרום הקלטה, בעלי חיים הכנה הסר את העקרב מהצנצנת הבית שלה יש להניח אותו במיכל מקורר מראש כוס; הבא, במקום את הצנצנת המכילה את העקרב לסביבה הקפאה (-5 מעלות צלזיוס) למשך תקופה מינימלית של שתי דקות. זמן זה עשוי להשתנות על פי גיל, גודל, מינים, וכו 'של העקרב ספציפי תחת מחקר. אבל בדרך כלל, שלב הסביבה הקפאת השלמת פעם החיה היא תנועה. אחרי שתי דקות, להסיר את העקרב משותקת ממכל זכוכית קר, למקם אותו בצד הגחון על שקופיות מיקרוסקופ. אבטח את העוקץ, זנב, רגליים, pedipalps עם חימר moldable (על בסיס שמן, ואן Aken Plastalina). הפוך את פלטפורמה שעליה לשים pectines של עקרב. התאם את אורך ורוחב של הפלטפורמה לפי גודל של pecten. בדרך כלל, הפלטפורמות שלנו בנויים מתוך מכסה זכוכית מיקרוסקופ ו – כ 10 (L) X 18 (W) מ"מ. ציית פעמיים צדדי דבק לפלטפורמת pecten, זמירה את הקלטת (במידת הצורך) כדי להתאים. כדי להפוך את חדר pectinal, לשים שלוש או ארבע של הפלטפורמה הצדדים בשעווה מראש נמס (אנו משתמשים שבבי שעוות דבורים 100%) עד לעומק של 3-4 מ"מ. אנחנו ממיסים את השעווה על ידי הנחת אסימונים בתוך צלחת פטרי זכוכית, הממוקם על פלטה חשמלית. לאחר שעווה בשולי החדר pectinal הוא מקורר לטמפרטורת החדר, זה אמור ליצור קירות של שעווה על 1 מ"מ גבוה. על החיה, לאתר את נקודת הכניסה pectinal, והמקום קצה בלתי שעווה של הפלטפורמה (קלטת בצד-up) האחוריים רק אליו. לאחר מכן, לייצב את הפלטפורמה (כך שלא יעברו בהמשך) על ידי לחיצה בעדינות את זכותה וקצוות היקפי שמאל נגד חימר השתמשו לרסן את הרגליים של החיה. השתמש קנס שקצהו מלקחיים בזהירות המקום pecten או pectines בתוך החדר. באופן ספציפי, באמצעות מלקחיים, להחזיק את pecten לאורך עמוד השדרה pectinal, ובעדינות להביא את pecten החוצה מתחת לזכוכית לכסות ומוריד אותה אל הרצפה פלטפורמה דבק. הקמת האג"ח pecten על קלטת בקפידה על ידי הפעלת לחץ על עמוד השדרה pectinal. עכשיו להחיל שעווה מותכת (אנו משתמשים מרית מתכת מחומם מראש) עד לקצה בלתי שעווה של הרציף. המטרה היא כפולה, כדי לאבטח את pecten באופן מלא לתחום את חדר המבוא שמן מינרלי בעתיד. היזהר בעת החלת שעווה מעל pecten של בעל החיים, כפי שאפשר הנזק pecten בשעווה כי הוא חם מדי. בניית תא pecten תושלם. בשלב הבא, ליצור חיבור אלקטרודות אדיש עם hemolymph של החיה ידי הוספת חוט כסף בין שני פלחי הזנב. 2. הקלטה תאיים סימולטני גירוי כימי אנו מכינים את חיה 24 שעות לפני ביצוע תאית, קצה ההקלטות, אשר, בין היתר (כלומר התאמה חיה למצב קבוע), מאפשר זמן אישית לעשות pipettes ממריץ של ספציפי (sensillum תלויי) בקוטר-קצה. אנו משתמשים חולץ micropipette להשגת מפרטים כאלה. באופן אידיאלי, בקוטר של pipettes הוא ≈ 2 מיקרומטר גדול יותר מאשר קוטר הנקבוביות sensillar. אנו להתאים את מפרט micropipette שלנו בהתאם עבור כל חיה. 1 שעות לפני ההקלטה, נוסיף 5 μl של שמן מינרלי לחדר pectinal, השריית pecten תחת שמן. לאחר מכן, אנו בעמדה חיה מתחת מיקרוסקופ רב עוצמה, אשר מזה זמן עבודה מטרות המרחק עלית תאורה. כדי לעורר כימית יתד sensilla, אנחנו מציגים tastants מימית (כלומר חומצת לימון ומלח) דרך המדיום שמן. ראשית, אנו משתמשים מילוי micropipette להזריק את החומר מהגוף לתוך פיפטה ממריץ. הערה: כל הפתרונות ממריץ אמור להכיל אלקטרוליט עבור המוליכות החשמלית. בשלב הבא, לאחר מיצוב פיפטה ממריץ על micromanipulator (במתקן ההקלטה), הכנס את האלקטרודה הקלטה לתוך בסופו של דבר, לפתוח בוטה של ​​פיפטה ממריץ. חשוב להבטיח מגע בין האלקטרודה מתכת פתרון ממריץ אלקטרוליטי. לאחר הכנת מעוגנת חשמלית (דרך האלקטרודה אדיש), פשוט להוריד את פיפטה דרך המדיום שמן על נקבוביות sensillar. משך גירוי כימי לכל sensillum pectinal יכול להשתנות ככל שלושים דקות לשנייה קטנה כמו אחד. באופן כללי, אנו יכולים מדגם יתדות מרובים (> 30) לכל טפטפת. במקרה פיפטה ממריץ הופך סתום בפסולת דקה, פשוט להחליף את פיפטה סתומים עבור פיפטה חדשה בשימוש. 3. הכנת בעלי חיים במשך ימים מרובים של ניסויים בבעלי חיים אם החיה היא לשמש במשך זמן ממושך, אנו ממליצים על שימוש חוזר לחדר pectinal והחלפת טיפה של שמן מינרלי עבור כל מפגש הקלטה. אחרי הקלטה של ​​יום נתון היא מוחלטת, הסר את ההקלטה החיה של הגדרת ולבצע לשטוף שמן מינרלי. Specifically, להוסיף עוד טיפה (5 μl) של שמן מינרלי אל החדר, וכן להסיר את כל הנפט. זה עוזר לצמצם את נוכחותם של ממריץ שיורית, אשר ייתכן דלפו של פיפטה במהלך הפגישה ההקלטה. לפני הפגישה הבאה, להוסיף טיפה אחת של שמן כפי שתואר לעיל. 4. נציג תוצאות: בהתאם לציוד הקלטה בשימוש (למשל מגבר מסוים, digitizing חומרה וכו '), תוצאה נציג היא הקלטה תאיים עם S: N יחס של לפחות 3:1. בנייה מוצלחת של החדר שמן מינרלי הכרחי לבודד גירוי כימי sensilla הפרט, כפי שהוא מספק מדיום להעברת tastants כימיים קוטבי (על בסיס מים) 8. אם יש מעט שמן מדי או בכלל, הפתרון ממריץ יתפשט מ sensillum רשמה אל sensilla השכנות, אשר עלולים לגרום התקף ממושך, בלתי מבוקרת של גירוי כימי 8.