Hücre Ölümü doğru değerlendirilmesi için modifiye Annexin V / Propidium İyodür Apoptoz Testi
Summary
Hücre ölümü değerlendirilmesi için doğru bir yöntem açıklanmıştır. Protokol birincil hücre hücre hatları ve geniş bir yelpazede hayvan modellerinde% 40 yalancı pozitif olaylar kadar ekran geleneksel Annexin V / propidium iyodür (PI) protokolleri, üzerine geliştirir.
Abstract
Hücresel apoptozis Çalışmaları flow sitometri tabanlı yöntemler sunulmasından bu yana önemli ölçüde etkilendi. Propidium iyodür (PI) hücreler, plazma zarı bütünlüğü ve geçirgenliği 1,2 farklılıklar üzerinden, canlı, apoptotik veya nekrotik eğer belirlemek için yaygın Annexin V ile birlikte kullanılır. Annexin V / PI protokolü apoptotik hücre 3 çalışmak için yaygın olarak kullanılan bir yaklaşımdır. Hücreleri 4,5 yaşayan boya hariç kapasitesini dayalı, ekonomik, istikrarlı ve hücre canlılığı iyi bir göstergedir, çünkü PI diğer nükleer lekeleri göre daha sık kullanılır. Bir hücreye girmek için PI yeteneği membran geçirgenliği bağlıdır; PI, sağlam bir plazma zarı 1,2,6 varlığı nedeniyle canlı ya da erken apoptotik hücre leke yapmaz . Geç apoptotik ve nekrotik hücreler, plazma ve nükleer membran bütünlüğünü sağlayarak, PI, membranlar yoluyla geçmesi, nükleik asitler içine enterkale ve kırmızı floresan 1,2,9 gösterilecek 7,8 azalır . Ne yazık ki, bu geleneksel Annexin V / PI protokollerini 10 sitoplazmik bölmesi içinde RNA PI boyama ile ilgili önemli sayıda yanlış pozitif olaylar (% 40), yol bulabilirsiniz. Gösteren yüksek oluşumu 10: (sitoplazmik oranları <0.5 nükleer) Birincil hücre ve hayvan modellerinde geniş bir yelpazede büyük hücreler ile hücre hatları etkilenir. Burada, geleneksel yöntemlere kıyasla hücre ölümü değerlendirilmesi için önemli bir gelişme sağlayan bir değiştirilmiş Annexin V / PI yöntemi göstermektedir. Bu protokol RNaz, boyama aşağıdaki hücre içine girişini teşvik etmek için hücre sabitleme sırasında hücresel geçirgenlik değişikliklerin yararlanır. Zamanlama ve RNaz konsantrasyonu her ikisi de bir sitoplazmik RNA kaldırılması için optimize edilmiştir. Sonuç olarak geleneksel Annexin V / PI protokolleri (sitoplazmik PI boyama <% 5 olaylar) üzerinde önemli bir gelişmedir.
Protocol
Discussion
Annexin V / PI protokolü burada sunulan geleneksel protokollerin değiştirilmiş bir sürümü ve PI için yüksek afinite sitoplazma RNA varlığı dikkate alır. Nükleer PI boyama boyama işlemi geç% 1 formaldehit fiksasyonu adım aşağıdaki RNaz A (50 mcg / ml) Giriş hassasiyeti önemli ölçüde artırır. Nükleer PI boyama veya plazma zarı Annexin V boyama olumsuz etkileri görülmektedir. RNaz bir tedaviye gerek kalmadan, PI leke sonuçlarının% 40 kadar downstream sonuçlar 10 bir potansiyel olarak anlamlı ve negatif bir etkiye yol açan yanlış pozitif olaylar, yol açabilir.
Modifiye Annexin V / PI boyama protokol basit ve hücre tipleri (İlköğretim hücreleri geniş bir yelpazede etkili bir şekilde kullanılır olmuştur: fare kemik iliği makrofaj ve dalak, domuz akciğer ikamet hücreleri, akciğer alveolar makrofajlar, mezenterik lenf nodu izolatları, periferik kan lökosit splenositlerin; tavuk blastodermin hücreler; goldfish birincil böbrek makrofajlar; sazan periferik kan lökosit, Hücre hatları: RAW 264,7 makrofajlar, Jurkat T hücreleri, domuz 3D4/31 makrofajlar, CCL-71 Japon balığı yüzgeci fibroblastlar, 3B11 kedibalığı B hücreleri 10). Hücreler farklı birincil hücreler genellikle yanlış pozitif olaylar (10) daha fazla sayıda olan yalancı pozitif PI boyama, etkilenen dikkat etmek önemlidir. Bu hücresel popülasyonlar arasındaki farklılıklar, yanlış pozitif PI boyama kısmen hücre boyutunda farklılıklar olabilir, ancak RNA içerik farklılıkları da neden olabilir. Bu yordamı, birleşme deneysel sistemler diğerleri arasında kullanmak, genotoksik stres geçiren hücreler, hücre döngüsü tutuklanması gibi timidin ya da hidroksiüre gibi ilaçlar, viral-enfekte olmuş hücreleri ve gelişim ilerlemesi embriyonik hücreler üzerinde çalışmaları ile tedavi edilen hücreler için özellikle ilgili olarak hücresel RNA sentezi ayrık değişiklikler ile karakterizedir.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışmada, Doğa Bilimleri ve Mühendislik Konseyi, Kanada (NSERC) araştırma bursu ve bir Alberta Tarım DRB Finansman Konsorsiyum hibe tarafından desteklenmiştir. AMR bir NSERC Vanier Kanada Yüksek Lisans Bursu, Alberta asistanlığa bir üniversite ve bir Kraliçe Elizabeth II yüksek lisans bursu ile desteklenmektedir.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| 1 x PBS-/- | ||||
| 1 x Annexin V Binding Buffer | BD Biosciences | 556454 | ||
| Annexin V-Alexa Fluor 488 | Molecular Probes (Invitrogen) | A13201 | ||
| Propidium iodide (PI) | Sigma-Aldrich | P4864 | 1 mg/mL in H2O | |
| 2% Formaldehyde | Sigma-Aldrich | F1268 | ||
| RNase A from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | R4642 | ||
| DRAQ5 | Biostatus | DR50050 | Dilute 1:60 in 1 x PBS-/- |
References
- Vermes, I., Haanen, C., Steffens-Nakken, H., Reutelingsperger, C. A novel assay for apoptosis. Flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on early apoptotic cells using fluorescein labeled Annexin V. J Immunol Methods. 184, 39-51 (1995).
- Vermes, I., Haanen, C., Reutelingsperger, C. Flow cytometry of apoptotic cell death. J Immunol Methods. 243, 167-190 (2000).
- Cornelissen, M., Philippe, J., De Sitter, S., De Ridder, L. Annexin V expression in apoptotic peripheral blood lymphocytes: An electron microscopic evaluation. Apoptosis. 7, 41-47 (2002).
- Fried, J., Perez, A. G., Clarkson, B. D. Flow cytofluorometric analysis of cell cycle distributions using propidium iodide. Properties of the method and mathematical analysis of the data. J Cell Biol. 71, 172-181 (1976).
- Bacso, Z., Everson, R. B., Eliason, J. F. The DNA of Annexin V-binding apoptotic cells is highly fragmented. Cancer Res. 60, 4623-4628 (2000).
- Darzynkiewicz, Z., Bruno, S., Del Bino, G., Gorczyca, W., Hotz, M. A., Lassota, P., Traganos, F. Features of apoptotic cells measured by flow cytometry. Cytometry. 13, 795-808 (1992).
- Kroemer, G., Dallaporta, B., Resche-Rigon, M. The mitochondrial death/life regulator in apoptosis and necrosis. Annu. Rev. Physiol. 60, 619-642 (1998).
- Denecker, G., Vercammen, D., Declercq, W., Vandenabeele, P. Apoptotic and necrotic cell death induced by death domain receptors. Cell Mol. Life Sci. 58, 356-370 (2001).
- Faleiro, L., Lazebnik, Y. Caspases disrupt the nuclear-cytoplasmic barrier. J Cell Biol. 151, 951-959 (2000).
- Rieger, A. M., Hall, B. E., Luong, L. T., Schang, L. M., Barreda, D. R. Conventional apoptosis assays using propidium iodide generate a significant number of false positives that prevent accurate assessment of cell death. J Immunol Methods. 358, 81-92 (2010).
- Edward, R. Minireview: Use of DNA-specific anthraquinone dyes to directly reveal cytoplasmic and nuclear boundaries in live and fixed cells. Mol. Cells. 27, 391-396 (2009).
- Njoh, K. L., Patterson, L. H., Zloh, M., Wiltshire, M., Fisher, J., Chappell, S., Ameer-Beg, S., Bai, Y., Matthews, D., Errington, R. J., Smith, P. J. Spectral analysis of the DNA targeting bisalkylaminoanthraquinone DRAQ5 in intact living cells. Cytometry Part A. 69, 805-814 (2006).
