تصوير الحية إزفاء PKC في Sf9 خلايا في الخلايا العصبية والحسية Aplysia
Summary
في هذا الفيديو ، ونظهر تصور إزفاء PKC في الخلايا الحية باستخدام PKCS الموسومة fluorescently.
Abstract
بروتين كيناز جيم (PKCS) هي السيرين ثريونين كاينيسات التي تلعب دورا مركزيا في تنظيم مجموعة واسعة من العمليات الخلوية مثل نمو الخلايا والتعلم والذاكرة. هناك أربع عائلات معروفة من الأشكال الإسوية PKC في الفقاريات : PKCS الكلاسيكية (α ، βI ، وβII γ) ، اكتب رواية أنا PKCS (ε η و) ، رواية من النوع الثاني PKCS (δ وθ) ، وPKCS شاذة (وι ζ ). يتم تنشيط PKCS الكلاسيكية كا 2 + وdiacylclycerol (DAG) ، في حين يتم تنشيط PKCS رواية همرشولد ، ولكن كا 2 + مستقلة. يتم تنشيط PKCS شاذة التي لا كا 2 + ولا همرشولد. في californica Aplysia ، لدينا نظام نموذجي لدراسة تكوين الذاكرة ، وهناك ثلاثة نظام محدد العصبي الأشكال الإسوية PKC واحد من كل فئة رئيسية ، هي التقليدية PKC APL انا ، انا اكتب رواية PKC APL الثاني والثالث شاذة PKC الألغام المضادة للأفراد. PKCS والدهون تنشيط كاينيسات ، وبالتالي فقد تم تفعيل PKCS الرواية الكلاسيكية واستجابة لإشارات خارج الخلية مرتبطة بشكل متكرر مع إزفاء PKC من السيتوبلازم إلى غشاء البلازما. ولذلك ، تصور إزفاء PKC في الوقت الحقيقي في الخلايا الحية قد أصبحت أداة لا تقدر بثمن لتوضيح مسارات نقل الإشارة التي تؤدي إلى تفعيل PKC. على سبيل المثال ، سمحت هذه التقنية بالنسبة لنا لإثبات أن الأشكال الإسوية المختلفة من PKC نقل من مكان لآخر في ظل ظروف مختلفة للتوسط أنواع متميزة من اللدونة متشابك وأن السيروتونين (5HT) تفعيل PKC APL الثاني يتطلب إنتاج كل من حمض الفسفاتيديك همرشولد و(السلطة الفلسطينية) من أجل إزفاء 1-2. الأهم ، والقدرة على تصور الخلية العصبية نفسها مرارا وتكرارا وقد سمح لنا ، على سبيل المثال ، لقياس الحساسية للاستجابة PKC بالتفصيل رائعة 3. في هذا الفيديو ، ونظهر كل خطوة من إعداد الثقافات الخلية Sf9 ، وقد وصفت الثقافات من الخلايا العصبية الحسية Aplysia في مقال آخر فيديو 4 ، معربا عن PKCS الموسومة fluorescently Sf9 في الخلايا والخلايا العصبية في Aplysia الحسية والعيش التصوير من إزفاء PKC ردا على تفعيل مختلفة باستخدام الليزر المجهر.
Protocol
Discussion
وقد وصفت لدينا التقنية لإزفاء صورة PKCS fluorescently المفتاحية في الوقت الحقيقي في Sf9 الخلايا والخلايا العصبية في Aplysia الحسية. Sf9 الخلايا توفير نظام بسيط لإزفاء صورة PKC منذ زراعة وtransfecting لهم هي جميلة على التوالي إلى الأمام. في المقابل ، microinjection من الخلايا العصبية الحسية <…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الكندية لمنح الصحة (CIHR) بحوث لاين S. Sossin. كارول ألف فرح وهو حاصل على زمالة ما بعد الدكتوراه من فون بحوث دي لا سانتي ان كيبيك (FRSQ) وزمالة هارينجتون كونراد. فإن الكتاب أود أن أشكر جوانا بوجي ، مارغريت هاستينغز واللبان مارغريت للمساعدة في تبادل لاطلاق النار الفيديو ومادلين ريتشموند حمام سباحة للحصول على مساعدة مع نظرة عامة على الرسم.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Sf9 frozen cells | Spodoptera frugiperda ovarian cells | Invitrogen | B825-01 | |
| Grace’s Insect Medium, Supplemented (1X), liquid | Reagent | Gibco | 11605-094 | Use to culture Sf9 cells |
| Corning 75cm2 canted neck cell culture flask | Tool | Corning | 430720 | Use to culture Sf9 cells |
| Fetal Bovine Serum | Reagent | CanSera | CS-C08-500 | Supplement Grace’s media with FBS prior to use |
| Syringe | Tool | Becton Dickinson | 309604 | Use to filter Fast Green solution |
| Syringe | Tool | Becton Dickinson | 309602 | Use to filter plasmid DNA / Fast Green solution |
| Filter | Tool | Corning | 431229 | Use to filter Fast Green solution |
| Filter | Tool | Corning | 431212 | Use to filter plasmid DNA / Fast Green solution |
| Glass Bottom Dish | Tool | Mattek | P35G-1.5-14-C | Use to culture Sf9 cells prior to transfection and imaging |
| Cellfectin II Reagent | Reagent | Invitrogen | 10362-100 | Used to express fluorescently tagged PKCs in Sf9 cells |
| Fast Green FCF | Reagent | Sigma-Aldrich | F-7252 | Use to visualize microinjection of plasmid DNA solution into Aplysia sensory neurons |
| Thin wall glass capillaries | Tool | World Precision Instruments | TW100F-4 | Use to make microelectrodes for microinjection |
| Microloader pipette tip | Tool | Eppendorf | CA32950-050 | Autoclave before using to fill up the microelectrodes for microinjection |
| PV820 Pneumatic PicoPump | Tool | World Precision Instruments | SYS-PV820 | Part of microinjection station |
| Microelectrode holder | Tool | World Precision Instruments | MPH6S | Use to hold microelectrode |
| Micromanipulator | Tool | Sutter | MP-85 | Use to position microelectrode in the three-axis |
References
- Farah, C. A., Nagakura, I., Weatherill, D., Fan, X. &. a. m. p. ;. a. m. p., Sossin, W. S. Physiological role for phosphatidic acid in the translocation of the novel protein kinase C Apl II in Aplysia neurons. Mol Cell Biol. 28, 4719-4733 (2008).
- Zhao, Y., Leal, K., Abi-Farah, C., Martin, K. C., Sossin, W. S. &. a. m. p. ;. a. m. p., Klein, . M.Isoform specificity of PKC translocation in living Aplysia sensory neurons and a role for Ca2+-dependent PKC APL I in the induction of intermediate-term facilitation. J Neurosci. 26, 8847-8856 (2006).
- Farah, C. A., Weatherill, D., Dunn, T. W. &. a. m. p. ;. a. m. p., Sossin, W. S. PKC differentially translocates during spaced and massed training in Aplysia. J Neurosci. 29, 10281-10286 (2009).
- Zhao, Y., Wang, D. O., Martin, K. C. Preparation of Aplysia sensory-motor neuronal cell cultures. J Vis Exp. , (2009).
- Manseau, F., Fan, X., Hueftlein, T., Sossin, W. S., Castellucci, V. F. Ca2+-independent PKC Apl II mediates the serotonin induced facilitation at depressed synapses in Aplysia. J. Neuroscience. 21, 1247-1256 (2001).
