Postsynaptische Recordings am afferenten Dendriten Kontaktaufnahme mit Cochlear inneren Haarzellen: Monitoring multivesikulären Veröffentlichung in einem Ribbon Synapse

1. Lösungen Lösungen können im Voraus vorbereitet werden. Extrazelluläre Lösungen können bei 4 ° C gelagert werden bis zu einem Monat. Aliquots der internen Lösung kann gefroren gelagert werden (-20 ° C). Stellen Sie sicher, dass die Lösungen bei Raumtemperatur sind vor Beginn der Experimente. Dissecting Lösung und extrazellulären Recording-Lösung (mM): 5,8 KCl, 144 NaCl, 0,9 MgCl 2, 1,3 CaCl 2, 0,7 NaH 2 PO 4, 5,6 Glukose, 10 HEPES, 1 Na-Pyruvat, pH 7,4 (NaOH), 300 mOsm. Für IHC Ca 2 + aktuelle Isolierung der extrazellulären Lösung kann wie angegeben geändert werden: 5,8 KCl; 114 NaCl, 0,9 MgCl 2, 1,3 CaCl 2, 0,7 NaH 2 PO 4, 5,6 Glukose, 10 HEPES, 30 TEA Cl, pH 7,4 (NaOH ); 300 mOsm. 1-2 um Tetrodotoxin (TTX) können an die extrazelluläre Lösung der Natriumkanäle blockieren und zu isolieren, exzitatorischen postsynaptischen Ströme oder Potentiale (EPSCs oder EPSPs) hinzugefügt werden. Intrazelluläre Aufnahme-Lösung (mm): 20 KCl, 110 K-Methansulfonat, 5 MgCl 2, 0,1 CaCl 2, 5 EGTA, 5 HEPES, 5 Na 2 ATP, 0,3 Na 2 GTP, 5 Na 2 phoshocreatine; pH 7,2 (KOH), 290 mOsm; oder 135 KCl, 3,5 MgCl 2, 0,1 CaCl 2, 5 EGTA, 5 HEPES, 4 Na 2 ATP, 0,2 Na 2 GTP, pH 7,2 (KOH), 290 mOsm. Intrazelluläre Lösung für IHC Ca 2 + Isolierung: 135 CsMeSO3, 13 TEA Cl, 3,5 MgCl 2, 2,5 Na 2 ATP, 1 EGTA, pH 7,2 (CsOH); 290 mOsm. Diese Lösung würde blockieren eine erhebliche Menge an dem viel größeren K + Leitwerte, wobei Ca 2 + Strom übrig. 2. Erstellen Halter für Dissected Tissue Geändert Deckgläser verwendet werden, um die Vorbereitung in die während Aufnahmen zu halten, kann auch im Voraus vorbereitet werden. Einen Tropfen Sylgard (Dow Corning, Midland, MI) an den Rand einer kreisförmigen Deckglas (8-12 mm). Legen Sie das dicke Ende eines feinen Insekten pin (FST, Art.-Nr. 26002-10) auf dem Deckglas. Halten Sie das Insekt pin fest gegen das Glas mit einer Pinzette und halten in der Nähe eines beheizten Spule mit dem Sylgard gesetzt. 3. Herstellung von Elektroden Bereiten Elektroden frisch auf jeden experimentellen Tag und in einem luftdicht ein. Fertigen Sie von 10 bis 20 Elektroden für jede Vorbereitung. Wählen Elektrode Glas, wir nutzen 1 mm Borosilikatglas Kapillaren (1B100F-4 von WPI, Sarasota, FL). Entwerfen Sie ein Programm auf einem mehrstufigen Puller Elektroden mit einer Spitze Durchmesser von etwa 2-3 um (~ 6 MOhm in Lösungen wie oben beschrieben) zu ziehen. Wir verwenden eine Sutter P-87 mehrstufige horizontale Abzieher oder ein Narishige vertikale PC-10-Abzieher. Sorgfältig Mantel der Schaft der Elektrode mit Sylgard als an der Spitze wie möglich zu schließen. Dies verringert Pipette Kapazität und verringert die Aufnahme Lärm. Fire-polnisch-Elektroden mit einem microforge mit einem Glühfaden, wie sie verfügbar WPI. Feuerpolierte Elektroden sollten einen äußeren Spitze Durchmesser von etwa 1 um (10-15 MOhm in Lösungen wie oben beschrieben). Die Dicke der Pipette Wand ist etwa 1 / 3 um. Der Außendurchmesser hat etwa die Größe des afferenten bouton gepatched werden. Im Falle der Durchführung gleichzeitiger Aufnahmen: IHC Pipette sollte in gleicher Weise (gleiche Glas, gleichzeitig zieht Programm) konstruiert werden, mit dem Unterschied, dass Feuerpolitur sollte eine größere Spitze Durchmesser von ~ 3 um (6 bis 8 MOhm) zu verlassen. 4. Einrichten des Experiment Füllen verbundenen Kammern die Schwerkraft zugeführt Perfusion mit extrazellulären Lösung und Testlösungen mit Drogen oder Toxine von Interesse. Set Perfusion, so dass Bad beläuft sich auf rund 2 mL, ständig mit einer Rate in der Größenordnung von 1,5 ml min-1 perfuse. Wenn verschiedene Lösungen während des Experiments mit einem lokalen Perfusion System angewendet werden sollen, füllen Reservoirs mit Lösungen. Run-Lösungen durch das System und sicherzustellen, dass es keine Luftblasen. 5. Dissection und Probenvorbereitung Der begleitende Film zeigt die Zerlegung des Corti-Organ für drei Wochen alten Ratten (Sprague Dawley, Charles River), die schwieriger als die von früher postnataler Stadien ist. Vorteile und Nachteile der Aufnahme von Ratten verschiedenen Alters sind in der Diskussion überprüft. Tief betäuben die Ratte von Isofluran beim Einatmen. Wenn Rückzug Reflexe fehlen und Corneareflexe sind schwer depressiv, enthaupten. Diese Verfahren wurden von der Johns Hopkins University Animal Care und Nutzung gebilligt worden ist. Entfernen Sie die Schnauze und die Haut von den abgeschlagenen Kopf. Man halbiere den Kopf und entfernen Sie das Gehirn, um die zeitliche Knochen freizulegen. Entfernen Sie die beiden zeitlichen Knochen und in saubere Sezieren Schalen mit Standard extrazellulären Lösung. Entfernenden Knochen Kapselung der Schläfenbein so wie die Cochlea aussetzen. Halten Sie das Schläfenbein sicher an der Basis mit einer Pinzette. Identifizieren Sie die runden und ovalen Fenstern. Richten Sie die Cochlea, so dass das ovale Fenster und spiralförmig Seite der Cochlea Gesicht nach oben und überschüssige Knochen zu entfernen um die Cochlea. Entfernen Sie die Knochen Verkapselung der Cochlea, die Sinnesepithel aussetzen, kümmert sich um die apikale Spule, die für den Versuch verwendet werden zu schützen. Verwenden Sie ein zweites Paar von feinen Pinzette an den Knochen direkt abplatzen der Cochlea, beginnend mit dem Gebiet, das mehr Transparenz als der Rest des Knochens. Hier ist der Knochen dünner und leichter zu entfernen. Entfernen Sie weiterhin die Knochen aus der ganzen apikalen Spule. Verwenden Sie Mikro-Präparierscheren durch den Modiolus unterhalb der apikalen wiederum abgeschnitten. Dann ziehen Sie das apikale wiederum aus der unteren Windungen der Cochlea. Verwenden Sie Mikro-Präparierscheren wieder, wenn nötig, um sicherzustellen, dass die apikale wiederum vollständig durchtrennt ist. Achten Sie auf die apikale Spule zu schützen, es sollte nicht gezogen oder gedehnt werden. Verwenden Sie die feinen Pinzetten zur apikalen wiederum vom Rest der Cochlea zu entlocken. Entfernen Sie den Rest des Knochens von beiden Seiten des apikalen einzuschalten. Entfernen Sie vorsichtig die Stria vascularis, die glänzende Streifen von Gewebe außerhalb der Haarzelle Region (Schematische 1) entfernt. Vergewissern Sie sich, um zu vermeiden das Entfernen der sensorischen Haarzellen, die leicht werden kann zusammen mit der Stria vascularis abgelöst. Verwenden feinen Pinzette die Tektorialmembran, die glänzende, halbtransparente Membran, die über den sensorischen Haarzellen sitzt lösen. Jetzt trimmen überschüssiges Gewebe und Knochen und glätten die Vorbereitung mit der Pinzette. Dies ist notwendig, so dass das Gewebe gleichmäßig unter einem Pin platziert werden. Ort der Vorbereitung unter den Stift an einem Deckglas (zuvor hergestellten), kümmert sich um den Stift weg von den Haarzellen Position. Verwenden einer Pinzette, um das Deckglas, um die Aufnahme Kammer übertragen. Sicherstellen, dass die Cochlea-Gewebe komplett mit einem Minus von extrazellulären Lösung, während die Übertragung der Deckglas bedeckt. Drücken Sie die Deckglas fest nach unten auf den Glasboden der Kammer, um sicherzustellen, dass es nicht während der Aufnahme zu bewegen. Sofort beginnen Perfusion mit extrazellulären Lösung, um ein besseres Überleben der Zubereitung zu gewährleisten. 6. Aufnahme Suchen Sie die Vorbereitung durch das Mikroskop Okulare mit der 10x und 40x die Wasserlagerung DIC Ziele. Richten Sie die Vorbereitung, so dass die Aufnahme Elektroden können IHZ orthogonal Annäherung an die Seitenwand des IHC. Wenn die Vorbereitung vorbei ist, gewellt Begrenzung Sichtbarkeit der basalen Region der IHZ, verwenden Sie eine Aufnahme Elektrode an den äußeren Rand des Präparates nach unten drücken gegen die Deckglas, wobei darauf zu achten Drücken der IHZ sich. * Bei Verwendung von jungen Ratten, in diesem Stadium der dicken Schicht aus Stützzellen über die Haarzellen mit einer Reinigungs-Pipette (mit einer Spitze Durchmesser von ~ 10-20 mu m), den Zugang zu den Sinneszellen 1, 12 gewinnen kann entfernt werden. Verwenden Sie den Monitor zu beurteilen, ob das Gewebe gesund ist. Mit einem 4X Vergrößerungslinse zwischen Mikroskop und das NC70 Newvicon Kamera weiter vergrößert das Bild und Projekte auf einer Fläche von etwa 4800 &mgr; m 2 auf dem Monitor. Haarzellen sollte mit intakten Haarbündel verlängert werden. Wenn das Gewebe verschlechtert, schwellen Haarzellen und transparenter geworden und körnig. Localize afferenten boutons um die Basis der IHZ. Boutons sind kugelförmig oder ellipsoid, ca. 1 um im Durchmesser und sind in hellen Farben mit einer glänzenden Auftritt. Die Mehrheit der boutons unter dem Niveau der Zellkern lokalisiert. Wenn das Gewebe ist ungesund boutons schwellen auf etwa 4-fachen der normalen Größe und transparent werden, anstatt glänzend. Füllen Sie eine Aufnahme-Elektrode mit intrazellulären Lösung, gelten Überdruck und die Nutzung der Mikromanipulator zu manövrieren die Elektrode an der Vorbereitung. Machen Sie einen Schnitt in der Vorbereitung auf der Ebene der IHC Basis mit der Elektrode. Schieben Sie die Elektrode zwischen der dünnen Schicht aus Stützzellen und der IHZ mit positivem Druck auf einen Zugang zu dem Gebiet am Fuße des IHZ zu schmieden. Dieser Schritt ist "Schlüssel" für das Erreichen der afferenten bouton und nicht die Aufnahme von Stützzellen, die eng umhüllen den afferenten Enden. Entfernen Sie vorsichtig die Elektrode und ersetzen mit einem frisch gefüllten Elektrode. Mit positivem Druck, um eine saubere Elektrodenspitze, Manöver der Elektrode durch die Zugangsöffnung an der Membran des IHC aufrecht zu erhalten. Der positive Druck sollte in Bewegung rund um den Stützzellen rund um die IHZ unterstützen. Bewegen Sie die Elektrode um benachbarte Stützzellen in Richtung der afferenten bouton (wie in der beiliegenden Film gezeigt. Ein alternativer Ansatz ist es, die afferente bouton, indem ein Ansatzlange der IHC-Membran, bis die Spitze der Elektrode berührt die bouton). Stellen Sie sicher, dass die Spitze der Elektrode direkt vor der afferenten bouton (es gibt noch eine kleine Lücke zwischen den bouton und die Elektrode aufgrund der positiven Druck auf die Pipette). Boutons bieten mehr Widerstand gegen die Bewegung der Pipette als die Stützzellen und den IHC-Membran, sie können "gefühlt" werden durch den Experimentator. Bewegen Pipette auf und ab und schieben, um sicherzustellen, dass die bouton bewegt. Dies deutet darauf hin, dass die Pipettenspitze und bouton in der gleichen Z-Ebene liegen. Mit der Elektrode gegen die afferenten bouton gedrückt, gleichzeitig Release Überdruck und Unterdruck anwenden, um eine GOhm Dichtung zu bilden. Die Bildung einer GOhm Siegel auf eine afferente bouton ist ähnlich wie auf einer Haarzelle. Seal Bildung kann schnell oder langsam erfolgen. Bewerben sanfte Ausbrüche von Saug-zur Ruptur der Membran innerhalb der Elektrode, und geben Sie die gesamte Zelle Aufnahme-Konfiguration. Wenn die Zelle gepatcht ist eine afferente bouton werden kleine kapazitiven Transienten auf dem Prüfstand Rechteckimpuls während Dichtung Bildung überwacht angezeigt (siehe Abbildung 1). 1,8 pF (siehe 3, 4) – Wir haben die Kapazität des afferenten Ende auf 0,4 geschätzt werden. Wenn die Zelle gepatcht ist ein IHC wird Transienten in der Größenordnung von 3-5 mal größer, je über den Zugang Widerstand. Um zu bestätigen, dass die Zelle eine afferente bouton ist, führen Sie ein Protokoll mit Hyperpolarisation und depolarisierende Spannung Schritte. Die Strom-Spannungs-Beziehungen (IVs) für afferenten Fasern und IHZ (oft fälschlicherweise als Ziel für einen afferenten bouton gepatcht) sind charakteristisch für die einzelnen Zelltypen und sind in Abbildung 2 dargestellt. Überwachen des Membranpotentials, für eine afferente Faser, ist es normalerweise etwa -60 bis -65 mV. Wenn die Zelle nicht ein afferenter bouton, entfernen Elektrode und wiederholen Sie die Schritte 8 bis 13 mit einem frisch gefüllten Elektrode. Verwenden Sie eine neue Elektrode für jeden Versuch. Monitor-Serie Widerstand während der Aufnahme durch Anlegen einer Spannung Schritte, um sicherzustellen, dass die Dichtung schließt nicht auf. Wenn Serienwiderstand steigt, kann es hilfreich sein, sanfte Impulse von Saug-zu beantragen oder die Elektrode leicht nach hinten zu verschieben. Vorwiderstände sind in der Regel rund 30 MOhm. Bei der Analyse der synaptischen Aktivität, verwerfen wir Aufnahmen mit Vorwiderstände größer als 50 MOhm. Sie können nun Rekord synaptische Aktivität (siehe Abbildung 3). Entweder wird die afferente Faser weist spontane Aktivität, oder die Haare Zelle benötigt, um sein depolarisiert zum Sender Release zu aktivieren. Anwenden einer extrazellulären Lösung mit einer höheren Kalium-Konzentration (zB 40 mM) wird depolarisiert die Haarzelle und oft zu aktivieren oder erhöhen Sie die Geschwindigkeit des Senders lösen. Für die simultane Aufnahmen von IHZ und afferenten boutons 2, sollte das Verfahren in folgender Weise modifiziert werden: Gehen Sie durch die Schritte 1 bis 5. Füllen Sie eine IHC Pipette mit dem entsprechenden intrazellulären Lösung für Ca 2 + aktuelle Isolation und folgen wie in 6 dargestellt. Verlassen Sie die Pipette für IHC Aufnahme in "Warteposition" in der Nähe des IHC aus aufgenommen werden. Fahren Sie mit Schritten 6 bis 14 für afferenten Aufnahme. Wenn die afferenten Pipette in Ganzzell-Konfiguration ist mit dem IHC Pipette weiter. Manöver der zweiten Pipette auf die Seitenwand des entsprechenden IHC, immer die Aufrechterhaltung positiver Druck. Die IHC sollte eine Vertiefung an der Seitenwand durch den Druck zeigen, und es muss sichergestellt werden, dass die Stützzellen von ihm getrennt werden. Schritte 12 bis 13 könnte für die IHC und angewendet werden. Wie in 14 gezeigt, im Vergleich zu den afferenten Fasern, sind größer kapazitiven Transienten, ein Markenzeichen von IHC Aufnahme, zusätzlich zu den charakteristischen IV Bezug. Sobald die gleichzeitige Aufnahmen etabliert sind, einige Zeit sollte erlaubt (3 bis 5 min, je nach Vorwiderstand) werden für die intrazelluläre Lösungen in den IHC waschen. Dies wird in größeren Ca 2 +-Ströme führen aufgrund der zunehmenden Block von viel größeren K + Leitwerte. Zur Erfüllung loose-Siegel extrazellulären Aufnahmen, bei Schritt 12, anstatt eine GOhm Dichtung, eine lose Dichtung von ca. 30 bis 50 MOhm auf die afferenten bouton. Dies kann durch die Anwendung weniger Saugleistung während die Freigabe der positive Druck erreicht werden. Siehe Abbildung 5 zeigt ein Beispiel einer extrazellulären Aufnahme von einem P21 Ratte afferenten bouton. 7. Trouble Shooting Wenn Dichtungen gebildet werden können, aber der Übergang von der Zellen-an ganzen Zellen Aufnahme kann nicht erreicht werden, kann der Innendurchmesser der Pipette zu schmal sein. Wenn Abdichtungen nicht gebildet werden können, kann die innere Pipette Durchmesser zu groß sein und die ganze bouton konnte bis in die Elektrode gesaugt werden. Wenn alle synaptischen Ereignisse kleinen und einheitlich sind, kann die Aufnahme extrazellulär sein, um die afferenten. Test für Umkehr der Ereignisse in positive Membranpotentiale; intrazellulär aufgenommenEPSCs wird bei positiven Potentialen rückgängig zu machen. Wenn Vorwiderstände konsequent hoch sind, wenn das Patchen afferenten Terminals, versuchen Sie die Pipette nach hinten, bevor der Durchbruch in die ganze Zelle Konfiguration. Dies hilft, Pipette Verstopfung und hohe Zugriffszahlen Resistenzentwicklungen vorzubeugen. Korrekte Position der Pipette furchtlos. Es ist möglich, die Elektrode zu bewegen, um hohe Serienwiderstand oder Pipette Verstopfung ohne "verlieren" die Dichtung an der afferenten reduzieren. Bei gleichzeitiger Aufnahme Gründung, ist der IHC in der Regel 'gedrückt' in Richtung der bouton. Die afferenten Pipette Position entsprechend korrigiert werden kann. 8. Repräsentative Ergebnisse Abbildung 1. AB. Typische Störungen von einer afferenten Faser (A) und IHC (B) in Reaktion auf eine 10 mV hyperpolarisierenden Spannung Befehl aus einem Betrieb Spannung von -94 mV aufgezeichnet. Aufgrund der engen Pipette Durchmesser und hohe Zugriffszahlen Widerstand, den IHC-Aufnahme (B) ist für die gesamte Zelle IHC Aufnahme suboptimal. Die Aufnahme wird hier nur auf die Differenz zwischen dem kapazitiven Transienten von IHZ und afferenten Fasern verdeutlichen gezeigt. Dies kann helfen, zwischen den Zelltypen unterscheiden bei der Bildung der whole-cell-Konfiguration. Whole-cell kapazitiven Transienten von IHZ sind in der Größenordnung von 5-mal größer in der Amplitude als solche aus afferenten Fasern. CD. Transienten von A & B in einem erweiterten Zeitrahmen dargestellt. C. Der Zerfall des afferenten Reaktion kann mit zwei Exponenten angepasst werden. Die Kapazität des afferenten Ende war von der schnellen Komponente geschätzt. Abbildung 2. IV Beziehungen aus einer afferenten bouton (A) und einem IHC (B). IV Beziehungen sind aus einem Betrieb Potential von -84 mV mit Spannung Schritte von -124 mV bis + 36 mV in 10 mV-Schritten (Nennspannungen) aufgezeichnet. Spannungen sind auf der rechten Seite einige Spuren gezeigt. Diese Aufnahmen wurden mit 5,8 mM extrazellulärem KCl bei Raumtemperatur durchgeführt. Maßstab für beide: 500 pA, 200 ms. A. IV Beziehungen aus einer afferenten Faser bei postnatalen Tag 19. EPSCs vorhanden sind während der Großteil der Spannung Schritte; EPSCs reverse positive bis +6 mV. Diese Aufnahme wurde in Gegenwart von TTX auf spannungsgesteuerten Na +-Ströme Block durchgeführt. Beachten Sie die langsam Aktivierung nach innen gerichteten Strom bei Hyperpolarisation Spannungen (I h). Dieser Strom ist nicht vorhanden in IHZ oder Stützzellen und bietet ein gutes Indiz, dass die Zelle aufgenommen aus einer afferenten Faser (siehe 3). B. IV Beziehungen aus einer P19 IHC. Aufgrund der engen Pipette Durchmesser und hohe Zugriffszahlen Widerstand, wird die Aufzeichnung suboptimal für die Charakterisierung von IHC Strömungen und die Ströme sind kleiner als erwartet. Die Aufnahme wird hier nur auf die IV Beziehungen der IHZ und afferenten Fasern nachweisen können, klar unterschieden werden, wenn eine afferente Faser Aufnahme versucht wird angezeigt. Beachten Sie die schnelle Aktivierung nach außen K +-Ströme bei positiven Potentialen (Pfeil) durch verzögerte Gleichrichter K + Ströme 13 an. Abbildung 3. Exemplar synaptischen Ströme aus einer afferenten Faser bei postnatalen Tag 21 in Gegenwart von 40 mM extrazellulärem K + auf die Geschwindigkeit der Freisetzung aus der IHC Anstieg zu verzeichnen. Raumtemperatur mit TTX angewendet spannungsgesteuerten Na +-Ströme zu blockieren. A. Mensur 200 pA, 5 ms, beachten Sie die variable Größe und Form der EPSCs. Für eine detaillierte Beschreibung der EPSC Eigenschaften siehe 4. B. Zwei EPSCs in A (#: mehrphasige, o: monophasischen) markiert auf erweiterter Stufenleiter gezeigt: Scale 100 pA, 1 ms. Abbildung 4. Gleichzeitige Aufnahme eines IHC und Kontaktierung afferenten bouton in einem ausgeschnittenen Ratte Corti-Organ, postnatalen Tag 10 (siehe auch 2). Eine Spannung Schritt depolarisierende der IHC provoziert Freisetzung von Neurotransmitter und aktiviert EPSCs in den afferenten bouton Obere Spur:. Voltage-Protokoll für IHC Depolarisation. Halten Potenzial: -79 mV, 50 ms Schritt bis -29 mV Nahen trace:. L-Typ Ca 2 +-Strömen aus der IHC aufgezeichnet zeigen typischerweise wenig Inaktivierung und Aktivierung bei negativen Potentialen Bottom trace:. Synaptic Ströme in den afferenten Fasern in Reaktion zu IHC Depolarisation. Beachten Sie die synaptische Depression während einer 50 ms IHC Depolarisation. Abbildung 5. A. Exemplar extrazellulären Aufnahme von einer afferenten bouton am postnatalen Tag 21. Dies wurde bei Raumtemperatur aufgenommentur, mit 5,8 mM extrazellulärem K +. Diese Aufnahme ist ein typisches Signal-Rausch-Verhältnis für eine Aufnahme in einer Zubereitung aus einem 3 Wochen alten Ratte. B. Durchschnittliche Wellenform für extrazelluläre Ereignisse aus einer P20 afferenten bouton aufgezeichnet. Dies ist die durchschnittliche Wellenform von 10272 Veranstaltungen. Schematische 1. Querschnittsansicht durch eine Umdrehung der Ratte Cochlea Darstellung der anatomischen Beziehung zwischen der inneren und äußeren Haarzellen, die Spiralganglien, Stria vascularis und Tektorialmembran.