1. Apuramento lisado Crescer E. culturas coli transformada com plasmídeo de DNA desejado no bem profundo placas (1 mL da cultura / poço) em caldo de Luria com antibiótico adequado durante a noite a 37 ° C com agitação. E. coli Pellet em placa de cultura em 5.000 xg por 10 minutos, em seguida, o sobrenadante decantar. Ressuspender cada pellet em 100 mL de buffer ressuspensão (50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 10 mM EDTA, 100 mcg / mL de RNase A). Adicionar 100 mL Tampão de Lise / poço (200 mM NaOH, 1% SDS) e agitar com placa shaker por 2 minutos. Adicionar 100 mL de buffer Neutralização / poço (3,0 M acetato de potássio, pH 5.5) e agitar por 2 minutos. Transferência lisado celular para lisado placa esclarecimento. Colocar a placa de ligação ao DNA em cima de 350 mL prato de coleta e coloque em baixo do colector de vácuo. Montar coletor de vácuo (ver Figura 1). Coloque placa de esclarecimento lisado em cima do aparelho de vácuo. Aplicar vácuo a 10 pol Hg (0,34 bar) e coletar DNA filtrado para placa de ligação. Não use vácuo superior a 12 pol Hg. (0,41 bar). Desmonte coletor de pó. Coloque 2 mL placa de coleta de lixo no fundo do aparelho. 2. DNA Binding Mover a placa de DNA de ligação ao topo do colector (ver Figura 2). Adicionar 300 mL de buffer / poço Binding (6 M de guanidina-HCl) e uma pipeta cima e para baixo para misturar. Aplicar vácuo [~ 5 pol Hg (0,17 bar) para vácuo lento] e descartar filtrado. DNA é agora obrigado a membrana. Lavar com 400 mL / poço de tampão de lavagem (80% de etanol). Aplicar vácuo, em seguida, descartar o filtrado. Descarte desnecessário se usar duas placas coleção mL ou filtragem diretamente para o lixo. Repita lave uma vez. Blot fundo da placa de filtro de papel absorvente para secar. Aplicar vácuo mais uma vez por 5-10 minutos para assegurar a remoção de resíduo de álcool. Blot fundo para assegurar a remoção de gotículas de etanol. 3. Eluição DNA Adicionar 70 mL tampão de eluição / poço (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 mM EDTA). Se maior concentração de DNA é desejado, o volume pode ser reduzido a 50 mL / poço, mas o rendimento médio total será menor. Incubar a placa em temperatura ambiente por um minuto. DNA purificado pode ser eluída por qualquer vácuo ou centrifugação. Método de vácuo: Coloque placa da coleção clean (DNase, RNase free) no colector de vácuo. Colocar a placa de filtro em cima do colector de vácuo, aplique vácuo de 15 pol Hg (0,5 bar) por 1 minuto até que todos tampão de eluição passou através da placa de DNA de ligação. Coletar DNA purificado (ver Figura 3). Método de centrifugação: Coloque placa de purificação do filtro em cima da placa da coleção clean e centrifugar a 1000 xg por 5 minutos. 4. As análises quantitativas e qualitativas Medida OD 260/280, calcular concentração de DNA purificado. Realizar análise de gel de agarose do PDNA purificada. 5. Resultados representante E. coli lisado clarificado utilizando centrifugação tradicionais e Pall AcroPrep Adiantamento Placas lisado esclarecimento de filtro mostrou redução significativa de detritos a partir de matéria-prima. (Figura 4). DNA do plasmídeo em três concentrações foi cravado em tampão TE e passado através da placa de esclarecimento AcroPrep Adiantamento lisado filtro. Uma comparação da concentração de DNA plasmidial, pré e pós-filtração, shows ~ recuperação de 100% (Figura 5) em todas as três concentrações. Para demonstrar a recuperação do DNA de E. esclarecidas coli DNA, lisado plasmídeo foi cravado em lisado bruto e, em seguida, esclareceu por filtração. O mesmo DNA do plasmídeo foi adicionado à célula de filtração após lisado. Eletroforese foi realizada em alíquotas de cada amostra (Figura 6). A banda, único e claro de intensidade semelhante de cada amostra demonstra pouco caso de qualquer perda de DNA durante a etapa de clarificação filtração-based. Culturas de E. coli contendo DNA plasmídeo PCAT foram purificados a partir de E. coli lisados usando mL da Pall 350 mL e 1 DNA de ligação placas de filtro, bem como duas outras marcas de 350 placas de DNA mL de ligação. Todas as purificações foram realizados conforme especificado no protocolo recomendado pelo fabricante. A maior concentração de DNA e rendimento total são vistos a partir mL da Pall AcroPrep um avanço placa DNA de purificação do filtro (Figura 7 e Tabela 2). Embora Concorrente W também mostra alta concentração de DNA (155 ng / mL), rendimento de DNA total é a mais baixa (4,7 mg / poço), devido ao volume de recuperação baixo, ~ 30 mL. Concorrente M deu a menor concentração de DNA de 108 ng / mL com um rendimento total de 5,6 mg / poço. Agarose gel análise de DNA purificado PCAT das três placas de DNA diferentes ligação é mostrado na Figura 8. Cada volume da amostra coletada foi ajustado para 65 mL para corrigir diferenças no volume de recuperação antes da eletroforese. Todas as amostras de DNA mostram superenrolado plasmídeo, mas o rendimento do DNA de cada uma das placas de filtro varia. Figura 9 mostra o DNA é tudo preparado na forma superenrolado e tem concentração similar. Figura 1. Montagem de Manifold vácuo de Esclarecimento Lysate. Figura 2. Montagem de Manifold de vácuo para Binding DNA. Figura 3. Montagem de Manifold de vácuo para eluição de vácuo. Figura 4. Filtração simplifica esclarecimento amostra. Triplicatas de 300 mL de lisado bruto clarificado por filtração a vácuo (350 mL AcroPrep Adiantamento placa esclarecimento lisado filtro) ou centrifugação tradicional. OD 320 medido antes e após esclarecimento. Figura 5. Recuperação total dos PDNA após a passagem por Antecipação AcroPrep placa de filtro lisado esclarecimento. 300 mL tampão TE enriquecida com PCAT a 25, 50 e 100 mcg / mL. Concentração de DNA e recuperação calculados a partir de 260 OD antes e após a filtração, N = 2. Figura 6. Recuperação de DNA PCAT após esclarecimento. Quantidades iguais de pUC19 cravado em lisado antes ou depois do esclarecimento, então diluída 1 a 10 em tampão TE. Loaded 2 mL / lane em 1,2% agarose gel. Figura 7. Maior rendimento de DNA plasmidial por poço com pall DNA Avanço Acroprep placa de filtro de ligação de chapas concorrentes. Rendimento DNA PCAT plasmídeo (OD 260) usando placas de purificação de DNA indicou com 1 mL (Pall e M Concorrente) ou 1,5 mL (Concorrente W) cultura overnight de DH5α. Purificação usando o protocolo recomendado pelo fabricante chapa. Barras de erro indicam o erro padrão (n> 6). Figura 8. Agarose gel análise de DNA purificado PCAT na placa de DNA indicaram vinculativo. 1,2% eletroforese em gel de agarose do PDNA purificada. Amostras combinadas de três purificações separado, eluato ajustada para 65 mL após purificação, 01:10 diluída. Loaded 2 mL por pista. Figura 9. Qualidade e de recuperação do DNA puro que quando os métodos de centrifugação ou a vácuo são usados para a final eluato eletroforese em gel de agarose coleção do PDNA purificada. Protocolo recomendado pelo fabricante de placas Adiantamento AcroPrep filtro foi seguido para a purificação PDNA. Eluição foi realizada por centrifugação a 1.000 xg por 5 minutos ou a vácuo com 15 pol Hg (0,5 bar) por 2 minutos.
