原核生物培養液からプラスミドDNAの合理化精製

1。ライセートクリアランス E.を拡大37℃で一晩、適切な抗生物質とルリアブロスのディープウェルプレートにおける所望のプラスミドDNA（文化/ウェルを1mL）°振とう℃で形質転換した大腸菌の培養。 その後、10分間5000 × gでの培養プレートでペレット大腸菌 、上清をデカント。 100μL再懸濁バッファー（50mMのTris – HCl、pH8.0の、10mMのEDTA、100μg/ mlのRNaseの）内の各ペレットを再懸濁する。 100μL/ウェル溶解バッファー（200 mMのNaOHを、1％SDS）を加え、2分間プレートシェーカーを用いて振る。 100 /ウェル中和バッファー（3.0 M酢酸カリウム、pH5.5）に追加し、2分間振とうする。 説明プレートをライセートに細胞ライセートを転送する。 真空マニホールドの底面に350μLコレクションプレートと場所の上にDNA結合プレートを置きます。 （図1を参照）真空マニホールドを組み立てます。 真空装置の上にライセートの清澄化プレートを置きます。 水銀10インチ（0.34 bar）で真空状態にしてDNA結合プレートにろ液を集める。水銀12インチよりも大きい真空を使用しないでください。 （0.41バール）。 吸引マニホールドを分解します。装置の底部に2mLの廃棄物収集プレートを置きます。 2。 DNA結合マニホールドの上にDNA結合プレートを移動する（図2を参照）。 300μL/ウェル結合バッファー（6 Mグアニジン- HCl）を追加し、混在させると上下にピペッティング。 [遅い真空用水銀インチ〜5（0.17バール）]真空を適用し、ろ液を捨てる。 DNAが今膜に結合しています。 洗浄緩衝液（80％エタノール）の400μL/ウェルで洗ってください。 真空を適用し、ろ液を捨てる。 2 mlのコレクションプレートを使用したり、無駄に直接フィルタする場合、不要な捨てる。 一度洗浄を繰り返します。 乾燥して吸収性タオルにフィルタープレートの底にしみ。 残留アルコールの除去を確実にするために5〜10分に一回以上の真空適用されます。 エタノール液滴の除去を確実にするために底部を覆い隠す。 3。 DNAの溶出 70ウェル/μlの溶出バッファー（10mMトリス- HCl、pH8.0の、1mMのEDTA）を追加します。高いDNA濃度が所望される場合、ボリュームは50μL/ウェルに低減することができるが、平均総収率が低くなります。 1分間室温でインキュベートする。 精製したDNAは、真空または遠心分離のいずれかで溶出させることができる。 真空法：真空マニホールドに清潔なコレクションプレート（DNase処理、RNaseフリー）。すべての溶出緩衝液は、DNA結合プレートを通過するまで吸引マニホールドの上にフィルタープレートを置き、1分間はHg（0.5バール）15インチの真空を適用する。 （図3を参照）DNAを精製収集する。 遠心法：5分間1,000 × gでクリーンなコレ​​クションプレートや遠心の上に配置浄化フィルタープレート。 4。定量的および定性的分析 OD 280分の260を測定し、DNAを精製したの濃度を計算する。 精製PDNAのアガロースゲル分析を行います。 5。代表的な結果 大腸菌は、従来の遠心分離とポールアクロアドバンスライセートの清澄化フィルタープレートを使用して明らかにライセートを出発原料から破片のかなりの減少を示した。 （図4）。 3つの濃度でのプラスミドDNAをTEバッファーに添加し、アクロアドバンスライセートの清澄化フィルタープレートを通過させた。プラスミドDNA濃度の比較は、事前事後のろ過、ショーは3つのすべての濃度で100％の回収（図5）を見る。 明らかE.からのDNAの回収を実証するために、 大腸菌ライセート、プラスミドDNAは、粗溶解物に添加し、濾過によって清澄化した。同じプラスミドDNAは、ろ過後の細胞のライセートに添加した。電気泳動は、各サンプルからアリコート（図6）上で行った。各サンプルから同様の強度の単一の、明確なバンドは、ろ過ベースの明確化のステップの間に少しあればDNAの損失を示しています。 E.の文化PCATプラスミドDNAを含む大腸菌は、大腸菌から精製した大腸菌は、ポールの350μL及び1mLのDNA結合フィルタープレートだけでなく、350μLDNA結合プレートの二つのブランドを用いてライセート。メーカーの推奨するプロトコルで指定されたすべての精製を行った。最高DNA濃度と総収量は、ポールの1 mLのアクロプレップアドバンスDNA精製フィルタープレート（図7および表2）から見られている。 他社Wも高いDNA濃度を（155 ng /μLの）示していますが、全DNAの収量は、（4.7μgの/ウェル）低い回復量に起因する最も低いです、〜30μL。競合他社のMは、5.6μgの/ウェルの総収率で108 ng /μLのでDNAの最低濃度を与えた。 寒天つの異なるDNA結合プレートからPCAT DNAを精製したのOSEゲル分析は、図8に示されています。各収集されたサンプルの量は、電気泳動の前に回復量の差を補正するために65μLに調整した。すべてのサンプルは、スーパーコイルプラスミドDNAを示しているが、フィルタープレートの各々からのDNA収量が異なります。 図9に調製されたDNAはスーパーコイル構造を取ってすべてであると同様の濃度が表示されます。 図1。ライセート清澄化のための真空マニホールドの組み立て 。 図2。 DNA結合のための真空マニホールドの組み立て 。 図3。真空溶出用真空マニホールドの組み立て 。 図4。ろ過は、サンプルの説明を簡素化します 。吸引ろ過（350μLアクロプレップアドバンスライセートの清澄化フィルタープレート）または従来の遠心分離によって清澄化粗溶解物の300μLのトリプリケートサンプル。 OD 320は、明確化の前と後に測定。 図5。アクロアドバンスライセートの清澄化フィルタープレート通過後PDNAの完全回復 。 300μLのTEバッファーには25、50および100μg/ mLでPCATでスパイク。 DNA濃度と回収率は、N = 2の前とろ過後のOD 260から計算。 図6。説明後のPCAT DNAの回収 。その後、明確化の前または後のライセートに添加pUC19の同量、TEバッファーで10に1を希釈した。 1.2％アガロースゲル上の2μL/レーンにロード。 図7。競合他社のプレートよりも飽きが来るアクロアドバンスDNA結合フィルタープレートでウェルあたりの高いプラスミドDNAの収量。1mLの（ポールと競合M）または1.5 mLで表示されたDNAの精製プレートを使用してPCATプラスミドDNAの収量（OD 260）（他社W）の一晩培養DH5α。板の製造業者の推奨するプロトコルを使用して精製。エラーバーは標準誤差（n個> 6）を示している。 図8。 PCATのDNAのアガロースゲル分析では、指示されたDNA結合プレートで精製 。精製PDNAの1.2％アガロースゲル電気泳動。 3つの別々の精製からプールされたサンプルは、溶出液は、精製、1:10に希釈した後、65μLに調整。レーンあたり2μLをロード。 図9。遠心または吸引方法は精製PDNAの最終的な溶出液を収集アガロースゲル電気泳動に使用されているときは同じような純粋なDNAの質と回復 。アクロプレップアドバンスフィルタープレートの製造業者の推奨するプロトコルは、PDNAの精製のために続いた。溶出は、2分間はHg（0.5バール）15インチで5分間または真空のために1,000 × gで遠心することにより行った。