Western Blotting: Preparação de amostras para detecção

1. Preparação da Amostra O primeiro passo para Western blotting é a preparação da amostra. Para preparar as amostras para a execução de um gel de células e tecidos precisam ser lisadas para liberar as proteínas de interesse. Um conveniente, reagente pronto para uso que é versátil e fácil de usar para extração de proteínas solúveis é CytoBuster ou PhosphoSafe. Estes buffers extração contêm detergentes otimizado para extração eficiente de proteínas solúveis a partir de células de mamíferos e insetos. A suave, a composição não-iônico de CytoBuster Reagente de Extracção de proteínas permite o isolamento de ativos endógenos ou funcionalmente proteínas expressas sem necessidade de tratamento secundário, como sonicação ou congelamento / descongelamento. PhoshoSafe tem a vantagem de conter quatro inibidores da fosfatase. Agregar as células por centrifugação a baixa velocidade (por exemplo, 5 min a 2500 xg), escorra o pellet celular também. Ressuspender as células em CytoBuster Reagente de Extracção de proteínas usando 150 mL por 10 6 células (quantidade ideal de CytoBuster Reagente de Extracção de proteínas pode variar de acordo com o tamanho da célula). Incubar a temperatura ambiente por 5 min. Transferência para um tubo adequado e girar por 5 min a 16.000 xg, a 4 ° C. Transferência apuradas sobrenadante (extrato celular) para um novo tubo e prosseguir com a análise. Para a extração de proteínas especializadas, recomendamos o uso de nossos alta qualidade Kits ProteoExtract. EMD tem mais de uma dúzia de kits para o isolamento mitocondrial, a extração de proteoma subcelular, a extração de proteínas transmembrana, e muitos outros. Visite nossa página de destino Western blot para mais detalhes. EMD também vende uma ampla variedade de protease e define fosfatase cocktail inibidor. Assim como ocorre lise, desfosforilação proteólise, e desnaturação começar. Estes eventos podem ser abrandado tremendamente se as amostras são mantidas em gelo ou a 4 ° C em todos os momentos e os inibidores apropriadas são adicionadas novas para o tampão de lise. Visite nossa página de destino Western blot para mais detalhes. 2. SDS-PAGE O segundo passo é a separação Western blotting proteína. As proteínas são separadas com base no peso molecular. Você pode fazer seu próprio gel PAGE, no entanto vamos estar usando um gel comercialmente pré-moldados. Depois de preparar a sua amostra, você está pronto para determinar a concentração de proteína. EMD tem dois kits para este para medir a concentração, sendo um deles a não-interferência Kit Ensaio de proteína e sendo o outro a BCA Protein Assay Kit. Uma vez que a concentração de proteína é avaliado estamos prontos para preparar a nossa amostra para o carregamento do gel. Anticorpos normalmente reconhecer uma pequena porção da proteína de interesse (referido como o epítopo) e neste domínio podem residir dentro da conformação 3D da proteína. Para permitir o acesso do anticorpo para esta parcela é necessário desdobrar a proteína. Para desnaturar, use um tampão de carregamento com a desnaturação sulfato de detergente aniônico dodecil sódio (SDS), e ferva a mistura em 95-100 ° C por 5 minutos. Um tampão de carregamento fácil e conveniente de usar é tampão de amostra 4X. Carregar a primeira pista do poço com marcador Trail Mix Protein. Este marcador tem três bandas de referência que permitem monitorar eletroforese. Quando o gel estiver manchado, bandas são visíveis desde 10 10-225 kDa. Preencha a unidade de eletroforese com tampão de corrida. Para géis PAGE, esta é geralmente 1X Tris-glicina. Para receitas de buffer mais detalhadas, visite a página de Western blotting. A Merck oferece reagentes de alta qualidade buffers com nossa linha química OmniPur. Executar o gel a 220V por 1 hora. Uma vez que as proteínas se separaram, mancha o gel com Coomassie blue para garantir as proteínas migraram de forma uniforme e uniformemente. RAPIDstain é uma mancha ultra-sensível, que está pronto para uso. Descoloração não é necessária. 3. Transferência de proteína Assim como proteínas com uma carga elétrica pode ser induzida a viajar por um gel em um campo elétrico, pode assim as proteínas ser transferidos em um campo elétrico a partir do gel para uma membrana, sendo ou PVDF ou de nitrocelulose. Hoje vamos fazer uma transferência molhado. Na transferência de molhado, o gel ea membrana são prensadas entre esponja e papel (esponja / papel / gel / membrana / papel / esponja) e todos são apertadas em conjunto, após garantir a ausência de bolhas de ar formada entre o gel ea membrana. O sanduíche está submerso em tampão de transferência para que um campo elétrico é aplicado. As proteínas de carga negativa viajar para o eletrodo com carga positiva, mas a membrana deixa-los, os une e as impede de prosseguir. Dois tipos de membranas são disponíveis: nitrocelulose e PVDF. Ambos funcionam bem. Hoje vamos estar usando PVDF. Membranas PVDF requerem imersão em methanol por alguns minutos, seguido de gelo do buffer de transferência fria por 5 minutos. O gel também precisa equilibrar por alguns minutos no gelo frio do buffer de transferência. Não fazer isso pode diminuir o gel durante a transferência. O buffer de transferência molhado é 1X Tris-glicina com metanol 20%. Preparações tampão detalhadas estão disponíveis em nosso website. Uma vez que a transferência estiver completa, é uma boa idéia para visualizar proteínas para assegurar uma transferência sem bolsas de ar. Isto pode ser feito facilmente com Blot RedAlert ocidental Stain. Esta mancha é ready-to-use e descoloração pode ser feito facilmente com água. 4. Anticorpos e reagentes de Acessórios O primeiro passo para fazer a sondagem e do anticorpo ao antígeno é bloquear a membrana. Bloqueio da membrana impede ligação não específica de fundo. Tanto de leite sem gordura ou BSA pode ser usado como uma solução de bloqueio. Entretanto, ao usar fosfo-anticorpos específicos, não é recomendado o uso de leite, uma vez que fará com elevado ruído de fundo. EMD oferece diversos reagentes de alta qualidade de bloqueio, incluindo SeaBlock, que é um agente não-mamíferos bloqueio e QuickBlocker BLOT, que é preparado, ready-to-use agente bloqueador. Temos também de alta qualidade BSA (Fração V) disponíveis. Incubar a membrana uma hora à temperatura ambiente sob agitação suave. Lavar três vezes em PBST TBST ou após a incubação. Uma maneira fácil e conveniente de fazer TBST ou PBST é usar o nosso comprimidos (comprimidos PBS TWEEN / Comprimidos TWEEN TBS) Uma vez que a membrana foi bloqueado, você está pronto para incubar com o anticorpo primário. EMD tem vindo a oferecer um portfólio completo de anticorpos excepcional, com a melhor garantia de anticorpos na indústria há mais de 30 anos. Lembre-se que, com todos os anticorpos EMD, oferecemos uma completa garantia 100% sem risco. Compra um anticorpo e usá-lo para qualquer especificidade de espécie ou aplicação que você deseja. Se o anticorpo não trabalhar para sua satisfação, nós forneceremos um crédito total para ser usado em qualquer outro produto. Para mais detalhes, visite a nossa página web Western blotting. Hoje vamos estar a incubar o nosso anticorpo primário usando uma solução de 1 de SignalBoost. SignalBoost é um grande produto permitindo que o seu sinal a ser melhorado significativamente. Simplesmente incubar o seu anticorpo primário em uma solução e incubar por 1 hora ou como faria normalmente. Não há necessidade de adicionar mais agentes bloqueadores. Alternativamente, você pode usar BSA ou leite em pó desnatado como um agente de bloqueio. Lavar com TBST. Fazemos TBST usando o pronto-a dissolver comprimido TBST. Incubar o seu anticorpo secundário usando uma solução de 2 de SignalBoost. Incubar o anticorpo secundário em tampão de bloqueio por 1 hora. Lavar a membrana de novo várias vezes com TBST. 5. Detecção Para HRP conjugando anticorpos secundários, ECL é tradicionalmente utilizada. Um reagente ECL excelente que oferecemos é RapidStep. As vantagens de RapidStep são de que haja mistura de luminal ou enhancer é necessária. Basta pulverizar a membrana algumas vezes e desenvolver usando x-ray filme. RapidStep oferece uma sensibilidade pictograma baixo, bem como emitir luz por até 2 horas após a adição de substrato.