המערבי סופג: הכנת המדגם איתור
Summary
המערבי סופג היא שיטה אנליטית לשמש כדי לזהות חלבונים ספציפיים בדגימה נתון homogenate רקמה או לחלץ.
Abstract
המערבי סופג היא שיטה אנליטית לשמש כדי לזהות חלבונים ספציפיים בדגימה נתון homogenate רקמה או לחלץ. היא משתמשת אלקטרופורזה בג'ל להפריד חלבונים יליד מפוגל או לפי אורך של פוליפפטיד (תנאים denaturing) או על ידי מבנה 3-D של חלבון (יליד / לא denaturing תנאים). חלבונים מועברים לאחר מכן קרום (בדרך כלל nitrocellulose או PVDF), שם הם בחנו (זוהה) באמצעות נוגדנים ספציפיים לחלבון היעד.
Protocol
1. לדוגמא הכנה הצעד הראשון במערב הוא סופג הכנת המדגם. כדי להכין דוגמאות להפעלת תאים ורקמות הג'ל צריך להיות lysed לשחרר את החלבונים של עניין. נוח, מוכן לשימוש מגיב כי הוא תכליתי וקל לשימוש להפקת חלבון מסיס הוא CytoBuster או PhosphoSafe. מאגרים אלה מכילים דטרגנטים מיצוי אופטימיזציה עבור מיצוי יעיל של חלבונים מסיסים מתאי יונקים חרקים. עדין לא יוניים הרכב מגיב הפקת CytoBuster חלבון מאפשר בידוד של אנדוגני פעיל מבחינה תפקודית או חלבונים הביעו ללא צורך לטיפול משני כגון sonication או הקפאה / הפשרה. PhoshoSafe יש יתרון נוסף של ובה ארבע מעכבי phosphatase. גלולה התאים על ידי צנטריפוגה במהירות נמוכה (5 דקות למשל XG ב 2500), לרוקן את תא גלולה היטב. Resuspend התאים חלבון מגיב CytoBuster הפקת באמצעות 150 μL לכל 10 6 תאים (כמות אופטימלית של הפקת מגיב CytoBuster חלבון עשויים להשתנות לפי גודל התא). דגירה בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות. מעבירים צינור מתאים ספין דקות 5 ב XG 16,000 ב 4 ° C. העברת פינה supernatant (תמצית התא) לצינור טריים להמשיך בניתוח. להפקת חלבונים מתמחים, אנו ממליצים להשתמש ערכות באיכות גבוהה שלנו ProteoExtract. EMD יש יותר מתריסר ערכות עבור בידוד המיטוכונדריה, מיצוי proteome subcellular, חלבון ממוצא הטרנסממברני, ועוד רבים אחרים. בקר בדף הנחיתה המערבי שלנו כתם לקבלת פרטים נוספים. EMD גם מוכרת מגוון רחב של פרוטאז ו מעכב phosphatase קובע קוקטייל. ברגע תמוגה מתרחשת, proteolysis dephosphorylation ו denaturation להתחיל. אירועים אלה יכולים להיות האטה מאוד אם הדגימות נשמרות על הקרח או על 4 מעלות צלזיוס בכל עת ומעכבי המתאימים טרי הוסיף למאגר תמוגה. בקר בדף הנחיתה המערבי שלנו כתם לקבלת פרטים נוספים. 2. SDS-PAGE הצעד השני במערב סופג הפרדה חלבון. חלבונים מופרדים על בסיס משקל מולקולרי. אתה יכול לעשות ג'ל בדף שלך, עם זאת אנחנו נהיה באמצעות מסחרית מראש יצוק ג'ל. לאחר הכנת המדגם שלך, אתה מוכן לקבוע את ריכוז החלבון. EMD יש שתי ערכות עבור זה למדוד ריכוז, אחד להיות ללא התערבות Assay חלבון קיט השני להיות ערכת Assay BCA חלבון. לאחר ריכוז חלבון נבחנת אנחנו מוכנים להכין המדגם שלנו לטעינת ג'ל. בדרך כלל נוגדנים להכיר חלק קטן של החלבון של עניין (המכונה epitope) לבין תחום זה עשוי לשכון בתוך קונפורמציה 3D של החלבון. כדי לאפשר גישה של הנוגדן לחלק זה יש צורך לפרוס את החלבון. כדי לפגל, להשתמש חיץ העמסה עם סולפט anionic denaturing נתרן dodecyl דטרגנט (SDS), ומרתיחים את התערובת על 95-100 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. מאגר העמסה קלה ונוחה לשימוש היא הצפת לדוגמא 4X. טען את הנתיב הראשון של דה מרקר היטב עם שביל לערבב חלבון. סמן זה יש שלוש להקות התייחסות אשר מאפשרים לך לפקח אלקטרופורזה. כאשר הג'ל הוא מוכתם, 10 להקות נראים הנעים 10-225 kDa. מלאו את יחידת אלקטרופורזה עם ריצה חיץ. עבור ג'לים PAGE, זה בדרך כלל טריס-1X גליצין. עבור למאגר מתכונים מפורטים, בקר בדף סופג המערבי. EMD מציעה באיכות גבוהה ריאגנטים מאגרים עם הקו שלנו כימיים OmniPur. הרץ את הג'ל על 220V במשך שעה 1. לאחר החלבונים נפרדו, הכתם ג'ל עם Coomassie כחול כדי להבטיח החלבונים היגרו באופן שווה ואחיד. RAPIDstain הוא Ultra-רגיש כתם שהוא מוכן לשימוש. Destaining לא נדרש. 3. חלבון העברה בדיוק כמו חלבונים עם מטען חשמלי יכול להיגרם לעבור דרך ג'ל בשדה חשמלי, ולכן ניתן החלבונים יועברו בשדה חשמלי של הג'ל על גבי קרום, להיות או PVDF או nitrocellulose. היום נעשה טרנספר רטוב. ב העברת רטוב, ג'ל לבין הממברנה הם דחוקה בין ספוג ונייר (ספוג / נייר / ג'ל / קרום / נייר / ספוג) וכולם היו שלובות בכוח לאחר הבטחת אין בועות אוויר נוצרו בין הג'ל לבין הממברנה. כריך הוא שקוע חיץ העברה אשר שדה חשמלי מוחל. החלבונים טעונים שלילית לנסוע לכיוון האלקטרודה חיובי טעון, אבל הממברנה עוצר אותם, נקשר אליהם, ומונע מהם להמשיך הלאה. שני סוגים של קרומים זמינים: nitrocellulose ו PVDF. שניהם עובדים היטב. היום אנחנו נהיה באמצעות PVDF. ממברנות PVDF דורשים טבילה methanoאני במשך כמה דקות, ואחריו חיץ קרים להעביר במשך 5 דקות. הג'ל גם צריך לאזן לכמה דקות במאגר העברת קרים כקרח. לא שהדבר עלול לכווץ את הג'ל במהלך ההעברה. חיץ להעברת רטוב הוא 1X טריס-גליצין עם מתנול 20%. ההכנות חיץ מפורט זמינים באתר האינטרנט שלנו. לאחר ההעברה תסתיים, זה רעיון טוב כדי להמחיש חלבונים כדי להבטיח אפילו להעביר ללא כיסי אוויר. זה יכול להיעשות בקלות עם כתם המערבי RedAlert הכתם. כתם זה הוא מוכן לשימוש destaining ניתן לעשות זאת בקלות עם מים. 4. נוגדנים ריאגנטים אביזר הצעד הראשון עושה חיטוט נוגדנים לאנטיגן היא לחסום את הממברנה. חסימת קרום מונע הלא ספציפית מחייב רקע. או שאינם שומן חלב או BSA יכול לשמש כפתרון חוסם. עם זאת, בעת שימוש phospho נוגדנים ספציפיים, לא מומלץ להשתמש בחלב כמו זה יגרום רקע גבוה. EMD כמה הצעות באיכות גבוהה ריאגנטים חוסם, ובכלל SeaBlock, שהוא סוכן שאינם יונקים חסימת QuickBlocker כתם, שהוא מוכן, מוכן לשימוש, חסימת סוכן. יש לנו גם באיכות גבוהה BSA (שבר V) זמין. דגירה השעה 1 הממברנה בטמפרטורת החדר תחת תסיסה עדינה. לשטוף שלוש פעמים TBST או PBST לאחר דגירה. דרך קלה ונוחה לעשות TBST או PBST היא להשתמש בטבליות שלנו (PBS טבליות tween / TBS טבליות tween) לאחר קרום נחסם, אתה מוכן דגירה עם הנוגדן הראשוני. EMD כבר מציעה סל מוצרים מקיף של נוגדנים חריגים עם ערבות הנוגדנים הטובים ביותר בתעשייה במשך 30 שנים. זכור כי עם כל הנוגדנים EMD, אנו מציעים מלא 100% ללא סיכון ערובה. רכישה נוגדן ולהשתמש בו עבור הספציפיות לכל מין או יישום שאתה רוצה. אם הנוגדן לא עובד לשביעות רצונך, נספק אשראי מלא כדי לשמש על מוצר אחר. לפרטים נוספים, בקר בדף האינטרנט המערבי שלנו סופג. היום נהיה דוגרים הנוגדן העיקרי שלנו באמצעות פתרון של SignalBoost 1. SignalBoost הוא מוצר נהדר המאפשר את האות להיות משופרת באופן משמעותי. פשוט דגירה הנוגדן העיקרי בפתרון 1 ו דגירה במשך שעה 1 או כרגיל. אין צורך להוסיף סוכני חסימה נוספת. לחלופין, ניתן להשתמש BSA או חלב דל שומן יבש כסוכן חסימה. לשטוף עם TBST. אנחנו עושים TBST באמצעות מוכנים להמיס טבליה TBST. דגירה נוגדן המשני שלך באמצעות פתרון של 2 SignalBoost. דגירה נוגדנים משני חסימת חיץ במשך שעה 1. לשטוף את הממברנה שוב מספר פעמים עם TBST. 5. איתור עבור נוגדנים HRP משני conjugating, ECL משמש באופן מסורתי. מגיב ECL מעולה שאנו מציעים הוא RapidStep. היתרונות של RapidStep הן כי אין ערבוב של luminal או משפר נדרשת. כל שעליך לעשות הוא לרסס את הממברנה כמה פעמים לפתח באמצעות רנטגן הסרט. RapidStep מציעה רגישות pictogram נמוך כמו גם פולטות אור עד 2 שעות לאחר תוספת של המצע.
Discussion
במצגת וידאו זה, יש לנו הדגיש את השלבים העיקריים במערב סופג אשר הכנת המדגם, SDS-PAGE, קרום חסימת / חיטוט עם נוגדנים, זיהוי. עבור כל שלב של התהליך, פרוטוקולים נאותה ריאגנטים המתאימים יש להשתמש כדי להשיג תוצאות באיכות גבוהה.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Materials
References
- Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proc Natl Acad Sci U S A. 76 (9), 4350-4354 (1979).
- Renart, J., Reiser, J., Stark, G. R., R, G. Transfer of proteins from gels to diazobenzyloxymethyl-paper and detection with antisera: a method for studying antibody specificity and antigen structure. Proc Natl Acad Sci U S A. 76 (7), 3116-3120 (1979).
- Burnette, W. N. ‘. W. e. s. t. e. r. n. blotting’: electrophoretic transfer of proteins from sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radiographic detection with antibody and radioiodinated protein A. Analytical Biochemistry. 112, 195-203 (1981).
- Ambroz, K. Improving quantification accuracy for Western blots Image Analysis. , (2006).
- Quan, Z. Reactive oxygen species-mediated endoplasmic reticulum stress and mitochondrial dysfunction contribute to cirsimartitin-induced apoptosis in human gallbladder carcinoma GBC-SD cells. Cancer Lett Article. , (2010).
- O’Malley, D. e. r. v. i. a. Alterations in colonic corticotrophin-releasing factor receptors in the maternally separated rat model of irritable bowel syndrome: Differential effects of acute psychological and physical stressors. Peptides. 31 (4), 662-670 (2010).
Cite This Article
Eslami, A., Lujan, J. Western Blotting: Sample Preparation to Detection. J. Vis. Exp. (44), e2359, doi:10.3791/2359 (2010).